CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在原發眼附屬器MALT淋巴瘤患者中的表達及臨床意義

李 鑫 楊 磊 葉 進 叢 佳 魏立強 姚 娜 楊 晶 崔雪瑩 王景文

黏膜相關淋巴組織邊緣區淋巴瘤(marginal zone mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma， MALT)是發生于B淋巴細胞的一類惰性淋巴瘤，好發于結外，包括胃腸道、眼附屬器、肺等組織器官的黏膜相關淋巴組織[1]。原發眼附屬器MALT淋巴瘤(ocular adnexal MALT，OAML)定義為原發于眼附屬器的MALT淋巴瘤，多數表現為眼附屬器局灶性病變，包括眼眶、結膜、眼瞼、淚腺等部位，僅少數發生全身多部位受累[1，2]。但因為病灶隱匿，往往被患者忽視，延誤病情，影響疾病的預后。

調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是抑制性T細胞的一種功能亞群，約占外周血CD4+T細胞數的1%～10%，Foxp3是Treg細胞的標志[3，4]。Treg細胞具有免疫調節和免疫抑制兩大功能，在實體瘤的腫瘤細胞生長、增殖過程中發揮關鍵作用，因此，對腫瘤的臨床進程、預后具有一定的預測作用[5，6]。然而，Treg細胞在血液系統腫瘤中的預測作用仍存在爭議。目前，國內外研究認為彌漫大B細胞淋巴瘤等侵襲性淋巴瘤患者外周血中Treg細胞數量明顯高于正常人[7～11]。但是，關于MALT淋巴瘤患者外周血Treg細胞的研究較少，尚無OAML的相關研究。本研究應用流式細胞儀檢測OAML患者外周血Treg細胞計數，并分析其比例與臨床分期、預后等因素的相關性，擬為原發于眼附屬器MALT淋巴瘤患者的病情監測、預后評估等提供新的血清學指標。

對象與方法

1.研究對象：連續性收錄2015年12月～2020年10月在首都醫科大學附屬北京同仁醫院診斷的OAML患者44例。入組標準：所有患者原發病灶均為眼附屬器，臨床上經病理明確診斷為MALT淋巴瘤，伴或不伴眼附屬器以外部位累及。排除標準：①既往曾進行針對MALT淋巴瘤的治療(除手術以外)；②確診前曾診斷其他惡性腫瘤；③確診前曾診斷自身免疫性疾病。所有病例經眼部腫物切除或者活檢送檢病理，符合2016年WHO淋巴造血組織腫瘤分類標準。收集入組患者的全身體格檢查、血液生化指標、影像學檢查等臨床資料，臨床分期采用Ann Arbor分期和眼附屬器淋巴瘤美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，預后評估標準采用淋巴瘤國際預后指標(international prognostic index，IPI)評分和MALT 淋巴瘤國際預后指標(MALT lymphoma international prognostic index，MALT-IPI)評分[12]。選取20名常規體檢未見異常的健康志愿者作為正常對照。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理審批號:TRECKY 2015-016)，所有入組患者均已簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器：單克隆抗體試劑盒:抗人CD4-FITC流式抗體、抗人CD25-PE-CyTM流式抗體、抗人Foxp3-APC流式抗體均為美國BD公司產品。裂解液、緩沖液和Foxp3破膜劑為美國Beckman Coulter公司產品。本研究使用的流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司制造的FC500型流式細胞儀。

3.實驗方法：抽取研究對象EDTA抗凝外周血2ml充分混勻備用。取10μl CD4-FITC及5μl CD25-PE-CyTM抗體加入100μl抗凝外周血中，渦旋振蕩混勻，避光孵育20min；加入Foxp3破膜劑A液1ml，渦旋振蕩混勻后避光20min，再加入Foxp3破膜劑B液1ml，300×g離心5min，棄上清，加入100μl Foxp3破膜劑B液重懸細胞；加入10μl Foxp3-APC，避光孵育30min，300×g離心5min洗滌1次，棄上清；加入緩沖液500μl，上機分析，記錄CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占全部淋巴細胞的比例。

4.治療方案：根據眼部腫物部位及浸潤程度，選擇腫物完全切除或者部分切除，一部分患者經眼科手術完全切除腫物無殘留病灶，另一部分眼科術后仍有殘留病灶。存在殘留病灶患者根據病變累及狀況、治療意愿等因素選擇等待觀察或進行治療，治療方案包括局部治療(單純放療)和系統性治療(單純化療、免疫化療、化療±放療、免疫化療±放療)。

5.療效評價：按照Lugano緩解標準分為完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、病情進展(progress disease，PD)和復發。在治療結束1個月及此后的每6個月進行療效評價，包括全身體格檢查、血液相關指標及MRI、PET/CT等影像學評估。

6.隨訪：采取門診檢查、住院復查或電話方式進行隨訪。總生存(overall survival，OS)定義為確診時間至死亡時間或隨訪終點，無進展生存(progression-free survival，PFS)定義為確診時間至病情進展或復發時間。本研究隨訪終點為死亡或2022年3月,隨訪時間為17～75個月，中位隨訪時間為43個月。

結 果

1.臨床特征：入組44例患者，其中男性28例，女性16例，男女性別比為1.75，中位發病年齡為60(20～79)歲。所有病例中僅2例伴LDH升高，3例伴B組癥狀。常見癥狀包括眼部異物感、眼瞼腫脹、無痛性腫塊、眼球突出、視力下降等，癥狀持續時間為1～120個月，中位時間為10個月。IPI評分和MALT-IPI評分低危、中危的患者分別為59.1%和52.3%、40.9%和38.6%，無IPI評分高危患者，MALT-IPI評分高危患者占9.1%。OAML患者中單眼受累29例(65.9%)，34.1%雙眼受累。眼部病變部位以眼眶(T2)最常見，共17例(38.6%)；單純累及結膜(T1)患者5例，占11.4%；9例T4患者中5例累及視神經，2例累及局部皮膚或皮下軟組織，1例累及副鼻竇，1例累及鼻腔。13例患者發生眼外組織受累，累及部位包括淋巴結(n=8)、骨髓(n=4)、肺組織(n=3)、皮下軟組織(n=3)、胸壁(n=2)，詳見表1。

表1 44例OAML患者的臨床特征

2.OAML患者與正常對照之間外周血Treg細胞比例的比較：入組44例OAML患者外周血Treg細胞比例為7.63%±3.77%，20例正常對照外周血Treg細胞比例為6.09%±1.02%，兩者比較，差異有統計學意義(P=0.015)。

3.不同累及部位OAML患者外周血Treg細胞比例的比較：44例患者根據病變累及部位進行分組，各組患者外周血Treg細胞比例詳見表2。雙眼受累患者外周血Treg細胞比例為9.22%±5.23%，高于單眼受累患者(6.80%±2.47%)，但兩者比較，差異無統計學意義(P=0.108)。病變局限于眼附屬器的OAML患者外周血Treg細胞水平為6.56%±2.42%，低于伴有眼外組織受累患者(10.16%±5.13%)，兩者比較，差異有統計學意義(P=0.030)。骨髓受累患者外周血Treg細胞比例為15.43%±3.98%，明顯高于無骨髓受累患者(6.85%±2.75%)，兩者比較，差異有統計學意義(P<0.001),詳見表2。

表2 不同累及部位患者外周血Treg細胞比例的比較

4.外周血Treg細胞比例與臨床參數的相關性分析：44例OAML患者外周血Treg細胞比例與血清LDH水平、IPI評分、MALT-IPI評分均無相關性(rLDH=-0.149，P=0.334；rIPI=0.120，P=0.437；rMALT-IPI=0.048，P=0.756)。

5.外周血Treg細胞比例與預后的關系：截至2022年3月，44例患者中PD或復發8例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、63.0%。取所有入組患者外周血Treg細胞比例的平均值7.63%為臨界值，將患者分為低Treg細胞組(28例)和高Treg細胞組(16例)，兩組患者的一般臨床資料匹配。低Treg細胞組中PD或復發3例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、92.9%；高Treg細胞組中PD或復發3例，3年OS率、PFS率分別為100.0%、66.8%，兩者比較，差異無統計學意義(P=0.155)，詳見圖1。

圖1 低Treg細胞組和高Treg細胞組PFS的比較

討 論

MALT淋巴瘤是一種來源于B淋巴細胞的血液系統惡性腫瘤，以異質性浸潤為主要特征。臨床上常表現為隱匿性淋巴結外無痛性腫物，病程緩慢，疾病初期不容易被發現，往往因影響周圍組織或器官功能才就診[13]。原發于眼附屬器的MALT淋巴瘤患者早期多無明顯癥狀，隨著腫物逐漸增大而出現相應癥狀，甚至影響眼部器官功能。眼部癥狀包括眼球突出、視力下降、頭痛等，病史可長達數年。本研究中入組患者就診前眼部癥狀持續時間最長可達10年。

CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞是一種特殊的CD4+T細胞亞群，它們通過抑制其他T細胞亞群的激活或增值，在調節免疫反應中發揮重要作用，從而維持免疫系統穩態[14]。Treg細胞不僅在自身免疫性疾病的發展中發揮重要作用，同時也抑制機體的細胞免疫功能，導致腫瘤細胞逃避機體的抗腫瘤作用[15，16]。大量研究表明，在實體瘤和血液系統腫瘤中，外周血Treg細胞比例均明顯升高[17～19]。Rollison等[20]在一項關于皮膚鱗狀細胞癌的前瞻性研究中發現，外周血中Treg細胞的比例與腫瘤發生的風險正相關，外周血中Treg細胞高表達患者發生皮膚鱗狀細胞癌的可能性是表達較低患者的4倍。Chen等[8]研究了77例彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，發現其外周血Treg細胞比例明顯高于正常對照，因此推斷外周血中較高的Treg比例可能反映了機體免疫抑制狀態。本研究也發現OAML患者外周血Treg細胞比例高于正常對照，與上述研究結果一致，提示Treg細胞的免疫逃逸可能在OAML的發病過程中發揮了作用。

OAML是一種臨床進程緩慢的惰性淋巴瘤，90%以上患者是以眼附屬器局限性病灶為主要表現，僅少數患者發生眼外部位的受累。這種疾病特點很容易讓患者甚至醫生忽略對于眼外病灶的評估。對于初診淋巴瘤患者，臨床工作中常使用多部位CT或PET/CT等影像學檢查，用來評估有無其他組織器官累及。此外，骨髓穿刺作為血液系統疾病常用的有創檢查，也被用于判斷有無骨髓受累的可能。目前尚未發現簡便易行的血清學指標，有利于預估OAML患者的病變累及部位。本研究發現，OAML伴有眼外組織受累的患者外周血Treg細胞比例高于病灶局限于眼附屬器患者，尤其是骨髓受累患者外周血Treg細胞比例明顯增高，提示Treg細胞比例增高可能與腫瘤的侵襲性相關。Treg細胞升高可能提示機體的免疫機制受損明顯，降低了機體對于腫瘤的防御能力，從而導致腫瘤的多部位侵犯。因此，筆者認為對于外周血Treg比例較高的眼附屬器MALT患者應該警惕眼附屬器以外部位的受累，建議盡早完善全身評估，尤其是骨髓的評估，避免延誤病情。

Dehghani等[21]總結了47例經典霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin′s lymphoma，cHL)與48例DLBCL患者發現，外周血Treg細胞比例在診斷開始時顯著升高，在一線治療后降低至正常范圍，但在復發/難治患者中顯著降低。因此，認為外周血Treg細胞的高水平可能是cHL和DLBCL患者對治療反應和復發等疾病結局的有利預后因素；推測復發患者外周血中Treg細胞顯著減少的一個可能原因是Treg細胞遷移至復發部位，從而在這些患者的腫瘤微環境中高度積累，導致外周血中Treg水平降低。由于本研究為回顧性研究，并未檢測治療后以及病情進展時期外周血Treg細胞比例，因此在進一步的研究中，可以通過檢測不同疾病階段、不同治療階段的MALT淋巴瘤患者外周血Treg比例，來探討其與疾病發生、發展的相關性。

另有研究發現，DLBCL患者中外周血Treg細胞高表達組(>8%)的總生存率高于Treg細胞低表達組(≤8%)，考慮Treg細胞在DLBCL患者中與不良預后相關，證實了Treg細胞在適應性免疫中的抑制作用[8]。本研究結果雖然未發現低Treg細胞組與高Treg細胞組之間的PFS比較，差異有統計學意義，但是筆者觀察到低Treg細胞組患者3年PFS率(92.9%)明顯高于高Treg細胞組(66.8%)。因此，筆者將在進一步的研究中，通過延長隨訪時間、擴大樣本量等措施，進一步探討外周血中Treg細胞水平是否可能與OAML的預后有關。

綜上所述，本研究發現Treg細胞在OAML疾病過程中發揮了免疫逃逸機制，其比例的增加與腫瘤的侵襲性相關。外周血中較高的Treg細胞水平可能提示眼附屬器以外部位受累，尤其是骨髓的受累。因此，OAML患者一旦發現外周血Treg細胞比例增高，應該盡早進行全身評估以明確疾病累及部位。