兒童肺炎支原體感染對免疫功能影響的研究

侯秋英 楊敏玲 祝峰 章愛蓮

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae,MP）是引起兒童下呼吸道感染的常見病原體，易感對象主要是5～14歲兒童[1]。近年來MP肺炎重癥較為多見，表現(xiàn)為起病迅速、病情危重等特點(diǎn)，如不及時治療，會對肺組織及肺外器官造成損傷[2]，其作用機(jī)制可能與大量炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)[3-4]。既往研究顯示，T淋巴細(xì)胞亞群功能紊亂在MP肺炎發(fā)病中起關(guān)鍵作用[5]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）是具有高度抑制活性的Treg，占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，主要調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞清除病原體反應(yīng)和炎癥引起過度免疫反應(yīng)之間的平衡[6]。已有研究報道顯示，機(jī)體CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有密切關(guān)系[7]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）/NF-κB信號通路是機(jī)體最重要的炎癥信號通路之一，可以調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性因子釋放，參與感染性疾病的進(jìn)展[8]。本研究探討兒童MP感染對機(jī)體免疫功能的影響，以期為臨床評估重癥MP感染提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年1月至2022年1月嘉興市第二醫(yī)院收治的兒童MP肺炎84例為研究對象，其中重癥組39例，輕癥組45例。重癥組男22例，女17例；年齡2～12歲，中位年齡7（5，9）歲；表現(xiàn)為肺實(shí)變15例，肺不張3例，胸腔積液6例，肺外表現(xiàn)2例（頭痛1例、心肌炎1例）；輕癥組男24例，女21例；年齡2～12歲，中位年齡7（6，8.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合兒童MP肺炎的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，同時符合以下條件：（1）咳嗽伴發(fā)熱；（2）MP感染標(biāo)準(zhǔn)：痰MP DNA＞1.0×103copies/ml或雙份血清MP-IgM陽性；（3）所有患兒檢測前未使用抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑；（4）臨床資料完整。重癥MP肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參考兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范[10]，符合以下任何一種情況屬于重癥：（1）有肺外并發(fā)癥者；（2）一般情況差；（3）有意識障礙；（4）低氧血癥；（5）超高熱或持續(xù)高熱＞5 d；（6）有脫水征/拒食；（7）≥2/3一側(cè)肺浸潤、多葉肺浸潤、胸腔積液、氣胸、肺不張、肺壞死及肺膿腫。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有細(xì)菌、病毒、真菌感染及肺結(jié)核、哮喘等疾病者；（2）血液系統(tǒng)疾病者；（3）使用糖皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑者；（4）支氣管肺先天畸形或結(jié)構(gòu)異常者；（5）存在認(rèn)知功能發(fā)育障礙者。另選取同期本院健康體檢兒童40名作為對照組，男22名，女18名；年齡2～12歲，中位年齡7（5，8.75）歲。3組兒童性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（倫理編號：jxey-2018053），8歲以上兒童均知情，所有患兒的法定監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有兒童于清晨空腹抽取靜脈血3 ml，置于黃色管中，24 h內(nèi)將標(biāo)本離心10 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm），分離血清，棄溶血標(biāo)本，取上清液-70℃凍存待測。同時在紫色抗凝管里采集靜脈血1 ml，輕輕搖晃后立即送至檢驗(yàn)科，行WBC及超敏C-反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP）檢測。（1）WBC和hs-CRP檢測 使用深圳邁瑞生物公司血常規(guī)分析儀器BC2600檢測WBC，乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法檢測hs-CRP。（2）血清炎癥因子水平檢測：使用鄭州安圖公司PHOMO酶標(biāo)分析儀，采用ELISA法檢測IL-6水平。使用美國BECTON DICKINSON公司的流式細(xì)胞儀，采用ELISA法檢測TNF-α水平。（3）血清Ig水平檢測：使用西門子公司特種蛋白分析儀，采用速率散射比濁法檢測 IgA、IgG、IgM。（4）外周血 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+Treg水平檢測：使用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司），并計算百分比。（5）TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測：采用Western blot法。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，采用RIPA細(xì)胞裂解液提取單個核細(xì)胞總蛋白，依次進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人一抗β-ac-tin、TLR4、髓樣分化因子 88（myeloid differ-entiation factor 88,MyD88）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB-α,IκB-α）和磷酸化IκB-α（p-IκB-α），4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL于暗室曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參，分析對比條帶強(qiáng)弱。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)分析TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組兒童WBC、hs-CRP和血清炎癥因子水平比較 重癥組和輕癥組患兒WBC、hs-CRP、IL-6、TNF-α水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），重癥組患兒WBC、hs-CRP、IL-6、TNF-α水平均高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組兒童WBC、hs-CRP和血清炎癥水平比較

2.2 3組兒童血清Ig水平比較 重癥組和輕癥組患兒IgA水平均低于對照組，重癥組患兒IgA水平低于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；重癥組患兒IgM水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組兒童血清Ig水平比較

2.3 3組兒童外周血T淋巴細(xì)胞水平比較 重癥組和輕癥組患兒 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對照組，CD8+、CD4+CD25+Treg水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；重癥組患兒CD4+、CD4+/CD8+水平均低于輕癥組，CD8+、CD4+CD25+Treg水平均高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 3組兒童外周血T淋巴細(xì)胞水平比較（%）

2.4 3組兒童TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 重癥組和輕癥組患兒TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、p-IκB-α水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；重癥組患兒TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、p-IκB-α水平均高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1和表4。

圖1 3組兒童TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 3組兒童TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.5 MP肺炎患兒TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、p-IκB-α表達(dá)水平分別與WBC、hs-CRP、IL-6、TNF-α、CD4+CD25+Treg均呈正相關(guān)（均P＜0.01），與CD4+/CD8+均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.01），見表5。

表5 TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析

3 討論

MP是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原體之一，廣泛存在于自然界中[11]。近年來，MP感染的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡提前，肺外并發(fā)癥增多[12]。重癥MP感染除呼吸道癥狀外，常伴有肺外多系統(tǒng)功能障礙，如血液系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，如不能及時有效地治療，不僅會影響生長發(fā)育，嚴(yán)重時還會威脅患兒生命[13]。MP感染的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為MP感染機(jī)體后引起促炎細(xì)胞因子過度釋放，產(chǎn)生過強(qiáng)的組織損傷，導(dǎo)致免疫功能失衡[14]。

IL-6是一種趨化因子，在介導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖及炎癥反應(yīng)中起重要作用[15]。TNF-α是一種促炎因子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和局部浸潤，吞噬和殺傷病原體，引發(fā)炎癥反應(yīng)[16]。WBC是臨床上用于檢測是否細(xì)菌感染的傳統(tǒng)指標(biāo)[17]。hs-CRP是一種β球蛋白，通過結(jié)合病原菌細(xì)胞壁的磷酸膽堿或炎癥損傷細(xì)胞暴露的磷脂等啟動免疫應(yīng)答[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥組和輕癥組患兒WBC、hs-CRP、IL-6、TNF-α水平均高于對照組，重癥組患兒上述指標(biāo)均高于輕癥組，提示MP感染促進(jìn)機(jī)體炎癥因子大量釋放，且表達(dá)水平與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)。既往研究已證實(shí)，MP的膜蛋白能直接附著于氣道上皮細(xì)胞，破壞上皮細(xì)胞功能，刺激氣道黏膜，分泌hs-CRP、IL-6及TNF-α等炎癥因子，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展[19]。

Ig是免疫細(xì)胞受到病原微生物刺激，由漿細(xì)胞合成與分泌，能夠同抗原產(chǎn)生特異性結(jié)合的球蛋白[20]。IgG是抗感染的主要抗體，是針對某種病原（如支原體、病毒等）產(chǎn)生的特異性抗體。IgM是初次體液免疫應(yīng)答早期階段的Ig，在感染早期發(fā)揮重要作用。而IgA主要在黏膜局部發(fā)揮免疫保護(hù)作用，能抑制病原微生物在呼吸道上皮附著，是防止病原體入侵的第一道防線[21-22]。本研究結(jié)果顯示重癥組和輕癥組患兒IgA水平均低于對照組，且重癥組IgA水平低于輕癥組，IgM水平高于輕癥組；而重癥組和輕癥組與對照組血清IgG水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MP感染后對IgM、IgA的表達(dá)有抑制，且隨感染的加重抑制作用越明顯，但對IgG水平影響不明顯，說明其抑制作用主要發(fā)生于感染早期。

T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中功能最大的細(xì)胞群，當(dāng)血清中T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量或占比發(fā)生異常，會引起免疫平衡的紊亂[23]。CD3+細(xì)胞屬于成熟的T淋巴細(xì)胞，代表機(jī)體細(xì)胞免疫功能的整體狀態(tài)[24]。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的中心，其比值反映免疫狀態(tài)，降低提示細(xì)胞免疫功能抑制[25]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的，具有抑制免疫調(diào)節(jié)功能的一組細(xì)胞亞群[26]。已有研究顯示，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制由細(xì)菌、支原體、病毒等病原感染后激發(fā)的免疫反應(yīng)，并通過多種途徑影響免疫狀態(tài)，抑制淋巴細(xì)胞的活化和增殖[27]。本研究中，重癥組和輕癥組患兒CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對照組，CD8+、CD4+CD25+Treg水平均高于對照組，且重癥組患兒CD4+、CD4+/CD8+水平均低于輕癥組，CD8+、CD4+CD25+Treg水平均高于輕癥組，提示感染越重對細(xì)胞免疫抑制越明顯，與申秋燕等[28]研究結(jié)果相一致。

TLR4/NF-κB信號通路是人體炎癥與免疫應(yīng)答的重要組成部分，在多種疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[29]。TLR4是機(jī)體識別病原微生物的關(guān)鍵受體，可以激活下游MyD88依賴性通路，MyD88介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路激活I(lǐng)KK，活化的IKK會泛素化、磷酸化并降解IκB-α，使得NF-κB p65與相應(yīng)的炎癥基因結(jié)合，啟動炎性因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答[30]。本研究結(jié)果顯示，重癥組和輕癥組患兒TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白水平均高于對照組，表達(dá)水平隨著疾病的嚴(yán)重程度增加而升高。TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)分別與WBC、hs-CRP、IL-6、TNF-α、CD4+CD25+Treg呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)。說明MP感染可以激活TLR4/NF-κB信號通路，誘導(dǎo)大量炎癥因子釋放，引起免疫功能紊亂，加重肺組織損傷。

綜上所述，MP感染會激活機(jī)體TLR4/NF-κB信號通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起Ig和淋巴細(xì)胞亞群水平發(fā)生異常，從而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。因此，臨床上MP肺炎可以通過評估炎癥因子、Ig和淋巴細(xì)胞亞群水平判斷病情的嚴(yán)重程度。