基于科學事實的PCR科學史重構(gòu)

顏廷喜 郭楓方 劉 露 程可昕 陳明林

（安徽師范大學安徽省重要生物資源與利用重點實驗室 安徽蕪湖 241000）

《普通高中生物課程標準（實驗稿）》在教學建議中提出“注重生物科學史的學習”，《普通高中生物學課程標準（2017年版2020年修訂）》（以下簡稱《新課標》）中再次提到“注重生物科學史和生物本質(zhì)的學習”。高中生物學課程不僅要求學生掌握基礎(chǔ)的生物學知識和基本的生物學能力，還要讓學生領(lǐng)悟科學家在研究過程中的思路和方法。學習生物學科學史能讓學生沿著科學家前進的腳步，理解科學的本質(zhì)和科學研究的思路和方法，促進生物學學科核心素養(yǎng)的形成。因此，教師要充分挖掘生物學科學史，對科學史資料進行恰當?shù)倪x擇和組織，這對中學生物學教學具有重要意義。

1 生物科學史的選擇要基于科學事實

科學事實是通過觀察和實驗所獲得的經(jīng)驗事實，是經(jīng)過科學整理和鑒定的確定事件。一個科學事實往往是先通過觀察，然后通過推斷，接著經(jīng)過一系列的驗證和應(yīng)用才被人所承認。科學事實具有重復性、精確性、可靠性等特征。科學事實是科學認識形成的基礎(chǔ)，學生要形成對生物學的正確認識，就要掌握正確的科學事實。

《新課標》頒布后，高中生物學教材也進行了一輪革新，教材內(nèi)容進行了一些調(diào)整，增添了生物科技進展、生物科學史話、科技探索之路、科學家的故事等欄目，介紹了生物學的最新進展以及生物科學的發(fā)展歷程。

《新課標》對生物技術(shù)與工程模塊提出幾個大概念，其中包括“基因工程賦予生物新的遺傳特性”，并提出開展以下教學活動：①DNA的提取和鑒定；②利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分和反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。目前，我國不同版本高中生物學教材對PCR發(fā)明時間表述不一（表1）。下面通過比較中美現(xiàn)有的幾種高中生物學教材，結(jié)合國內(nèi)外對PCR反應(yīng)的相關(guān)文獻資料、采訪、自傳等，探索PCR發(fā)明歷程，確定其發(fā)明時間。

表1 不同生物學教材中對PCR發(fā)明時間的描述

目前，生物學教材中對PCR發(fā)明時間的描述主要是1983年和1985年。那么，PCR技術(shù)到底是哪一年發(fā)明的呢？

2 PCR科學史

為準確把握PCR發(fā)明的時間歷程，依據(jù)穆里斯發(fā)表的《聚合酶鏈反應(yīng)的不尋常起源》《心靈裸舞》和保羅·拉比諾發(fā)表的《PCR傳奇：一個生物技術(shù)的故事》等有關(guān)資料，對PCR的發(fā)明歷程進行梳理。

2.1 PCR的發(fā)明過程

穆里斯的自傳《心靈裸舞》中描述到，1983年4月的一個周五晚上，穆里斯在128公路開車的過程中構(gòu)思出PCR的概念。接著，穆里斯在Cetus圖書館進行相關(guān)文獻檢索，又詢問公司內(nèi)外的科學家和技術(shù)人員，但沒人聽說過這種技術(shù)。1983年8月，穆里斯首次在Cetus公司會議上提出PCR的概念。那時，僅有幾個人感興趣。

1983年9月到12月，穆里斯開始一系列的實驗。1983年9月8日，穆里斯進行第一次PCR實驗，以人類生長因子基因作為擴增目標，分離出一段長約400 bp的片段，采用11 bp和13 bp長的寡核苷酸引物以及聚合酶商用緩沖液，將它們放在一個試管里進行加熱、冷卻、再加熱，第一次實驗并沒有成功。在10月份進行的第二次PCR實驗中，穆里斯利用相同的試劑和程序，進行加熱溶液、冷卻和添加酶的5或10個循環(huán)，第二次實驗還是沒有成功。

接下來，穆里斯繼續(xù)深入地探索。穆里斯和助手法魯納選擇一個較小的目標，采用細菌質(zhì)粒并嘗試更小反應(yīng)體積和更集中的反應(yīng)。實驗結(jié)果表明在凝膠中確實有東西被擴增，但不能明確說明擴增了多少。穆里斯認為他和法魯納建立了成功的PCR反應(yīng)。

雖然穆里斯已經(jīng)積累一定的實驗數(shù)據(jù)，但仍沒有明確的證據(jù)證明PCR實驗取得成功。

直到1984年10月底，日裔研究員才木全職從事PCR工作。1984年11月15日，才木等人的實驗證明有適當大小的產(chǎn)物被擴增，但結(jié)果仍然不能令人信服。他們需要更明確的數(shù)據(jù)來證明特異性。

1984年冬～1985年春，才木等人進行擴增β-珠蛋白的實驗，團隊成員用可靠和可量化的數(shù)據(jù)證明，他們可以將目的基因組DNA擴增數(shù)十萬倍，實驗結(jié)果通過放射性定量特定序列的數(shù)量和使用寡聚體限制分析來確定。

1985年，Cetus公司計劃在10月下旬召開的美國人類遺傳學會議上介紹PCR在人類遺傳病中的應(yīng)用。Cetus公司要求穆里斯根據(jù)pBR322質(zhì)粒的實驗數(shù)據(jù)撰寫一篇關(guān)于PCR理論概念的文章；另一篇關(guān)于β-珠蛋白PCR擴增的應(yīng)用性文章在理論性論文后提交。但穆里斯堅決反對公司計劃，他主張將PCR作為一個商業(yè)秘密，不發(fā)表任何文章。

1985年9月20日，才木等人如期提交了PCR應(yīng)用性的文章《酶促擴增β-珠蛋白基因組序列和限制性位點分析用于診斷鐮狀細胞性貧血》（Enzymatic amplifi?cation of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia），1985年12月發(fā)表在上。

1985年12月，穆里斯向雜志提交PCR理論性文章《通過聚合酶催化的鏈式反應(yīng)在體外特異性合成 DNA》（Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction），但這篇論文被拒了；穆里斯重新向提交這篇文章，文章也被拒。公司建議穆里斯將兩次被拒絕的文章提交給。當這篇文章1987年發(fā)表在時，PCR的信息已廣為人知。

將PCR引入機器的最后環(huán)節(jié)是需要一種更有效、更特異的聚合酶。穆里斯在1986年第一個提出使用耐熱的聚合酶，Cetus公司在1988年將提純的熱穩(wěn)定DNA聚合酶運用到實驗中，實驗效果比之前更好。于是，1988年才木等人在上發(fā)表了《引物導向的酶促擴增DNA與熱穩(wěn)定DNA聚合酶》（Primer-direct?ed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase）的文章，使得PCR技術(shù)獲得真正的實踐意義。

直到1987年6月，PCR專利才出現(xiàn)。

2.2 PCR技術(shù)相關(guān)文獻及其說明（1985—1988年）

1985年，才木等人在上發(fā)表了的論文是第一篇正式發(fā)表的PCR文章，采用新方法建立鐮狀細胞性貧血的快速、高靈敏度產(chǎn)前診斷實驗，反復的變性、引物退火和延伸循環(huán)導致引物連接的110堿基對區(qū)域成指數(shù)積累。種新方法就是聚合酶鏈式反應(yīng)。

1986年，穆里斯在冷泉港定量生物學研討會上進行《DNA體外特異性酶促擴增：聚合酶鏈式反應(yīng)》（Spe?cific enzymatic amplification of DNA in vitro：the poly?merase chain reaction）的報告。

1986年，沙爾夫等人在上發(fā)表了《酶促擴增基因組序列的直接克隆和序列分析》（Direct clon?ing and sequence analysis of enzymatically amplified ge?nomic sequences）。

1986年，才木等人在上發(fā)表了《用等位基因特異性寡核苷酸探針分析酶促擴增的β珠蛋白和HLA-DQα DNA》（Analysis of enzymatically amplified β-globin and HLA-DQα DNA with allele-specific oli?gonucleotide probes）。

1987年，穆里斯和法魯納的《通過聚合酶催化的鏈式反應(yīng)在體外特異性合成DNA》在上發(fā)表。這篇文章是1985年穆里斯投給和被拒的文章，也是Cetus公司要求發(fā)表的兩篇文章之一。

1987年，才木等人在上發(fā)表了《使用擴增單拷貝DNA的直接基因組測序表征β-地中海貧血突變》（Characterization of β-thalassaemiamutations using direct genomic sequencing of amplified single copy DNA）。在PCR中使用耐熱DNA聚合酶（Saiki等人準備中的手稿），將PCR和擴增產(chǎn)物的序列分析相結(jié)合應(yīng)用于人類單拷貝基因。

1988年，才木等人在上正式發(fā)表了《引物導向的酶促擴增DNA與熱穩(wěn)定DNA聚合酶》，從棲熱菌中分離出來的DNA聚合酶極大地簡化PCR程序，并且擴增反應(yīng)能夠在更高的溫度下進行，顯著提高擴增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量、靈敏度和長度。1989年，將DNA聚合酶譽為“年度分子”。

1988年，福克斯等人在上發(fā)表了《聚合酶鏈反應(yīng)以低成本實現(xiàn)自動化》（Poly?merase chain reaction automated at low cost），Cetus公司推出了第一臺PCR自動儀，PCR實現(xiàn)自動化。

PCR技術(shù)從1985年正式發(fā)表以來，經(jīng)過兩三年發(fā)展，在1988年應(yīng)用得到井噴式增長。1985～1987年，發(fā)表文獻僅10篇，都是Cetus公司研究員所發(fā)表的，到1988年發(fā)表的文章達上百篇。紐約時報評價PCR技術(shù)將生物學劃分為PCR前時代和PCR后時代。

2.3 明確PCR技術(shù)發(fā)明時間

只有當一個實驗系統(tǒng)被開發(fā)出來時，PCR技術(shù)才能成為一個科學實體。穆里斯在1983年提出了多聚酶鏈式反應(yīng)的概念，在當時僅僅是一種概念，并沒有成為一種技術(shù)。因此，1983年P(guān)CR技術(shù)并未真正誕生，當時只是提出了多聚酶鏈式反應(yīng)的概念。值得一提的是，1971年發(fā)表的一篇文章中提到了雙引物系統(tǒng)和“修補復制”的概念，這是PCR的雛形，不過基于此的經(jīng)驗思路沒有實現(xiàn)。

1985年，才木等人的《酶促擴增β-珠蛋白基因組序列和限制性位點分析用于診斷鐮狀細胞性貧血》文章在上發(fā)表，代表著PCR技術(shù)的誕生。科學事實的一個重要特征就是可重復性，1985年之前的實驗無法滿足重復性這一特征，也無法證實擴增條帶的特異性，1985年的β-珠蛋白基因組序列的酶切擴增實驗?zāi)軌蜃C實擴增序列具有特異性，也具有重復性。穆里斯關(guān)于PCR的構(gòu)想終于在才木和法魯納等人的幫助下取得成功。

因此認為1985年穆里斯等人發(fā)明了PCR技術(shù)。

3 PCR技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

3.1 實時熒光定量PCR

最初的PCR技術(shù)通過凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測，只能定性分析，不能定量分析。1992年，Higuchi開發(fā)了實時熒光PCR技術(shù)，開啟了PCR由定性到定量的應(yīng)用。在Higuchi等人DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測實驗中，利用溴化乙錠（EtBr）結(jié)合到雙鏈DNA中，通過增強熒光信號來檢測每個PCR中DNA的積累，熱循環(huán)過程中熒光積累的動力學與DNA拷貝的起始數(shù)量相關(guān)。這種方法分析特異性DNA序列，可在一定范圍內(nèi)定量檢測，一旦開始擴增就不需要打開試管取樣，減少了所需的人工量，簡化了過程，降低了PCR產(chǎn)品污染的風險。

實時熒光定量PCR是目前市場上最主流的PCR技術(shù)，成熟應(yīng)用于各種分子生物學研究和醫(yī)學研究之中，但依賴Cycle threshold值（簡稱CT，即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所需要的循環(huán)數(shù)）的相對定量方式、靈敏度低等特征限制了其在很多臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.2 PCR的應(yīng)用

PCR技術(shù)目前在醫(yī)學診斷、食品檢測、農(nóng)業(yè)科學等許多方面均有廣泛應(yīng)用，是世界上所有分子生物學實驗室最常規(guī)、基礎(chǔ)的實驗技術(shù)之一。在病原體的檢測中，許多病原體已經(jīng)有相應(yīng)的PCR檢測試劑盒。這些試劑盒能高效率、敏感地找出潛伏病毒的存在。

在新冠疫情下，新冠核酸檢測已成為世界人民生活的一部分。目前的新冠病毒核酸檢測大多采用熒光定量PCR技術(shù)。將新型冠狀病毒核酸RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以新冠病毒的cDNA為靶基因，通過PCR擴增，使這段靶DNA序列呈指數(shù)級增加，每一個擴增出來的DNA序列都可與預(yù)先加入的一段熒光標記探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。擴增出來的靶基因越多，累計的熒光信號就越強。因此，核酸檢測就是通過檢測熒光信號的累積來確定樣本中是否有病毒核酸。