溶酶體跨膜蛋白5在卵巢癌細胞上皮-間質轉化中的作用

姜曉鳳，蔡鑫澤，張巖，魏力

（中國醫科大學 1.附屬第四醫院婦科，沈陽 110032；2.附屬第一醫院中心實驗室，沈陽 110001）

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，死亡率居生殖系統惡性腫瘤首位。滿意的腫瘤細胞減滅術和術后以鉑類為基礎的化療是目前主要的治療方式［1-2］。尋找有效的治療靶點是卵巢癌基礎、臨床研究中亟待解決的問題。

溶酶體跨膜蛋白5（lysosomal protein transmembrane 5，LAPTM5），主要定位于晚期溶酶體和核內體內，在造血組織中呈高表達，其編碼基因位于染色體1p34［3］。研究發現LAPTM5在T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）和B細胞抗原受體（B cell receptor，BCR）的降解環節［4］，自身免疫性疾病［5］、炎癥性腸病［6-7］、腫瘤細胞增殖和轉移等發面發揮作用，在卵巢癌中，LAPTM5的表達及其對卵巢癌惡性生物學行為的影響尚不清楚。

腫瘤細胞上皮-間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細胞轉移和耐藥過程中發揮重要作用［8］。本研究擬探討LAPTM5在卵巢癌細胞中的表達情況，外源性沉默LAPTM5后卵巢癌細胞EMT相關指標的變化及其對卵巢癌細胞遷移、侵襲能力的影響，旨在為卵巢癌靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人卵巢腺癌細胞株OVCAR3購自美國組織培養庫（American Tissue Culture Colection，ATCC）。宮頸癌細胞株（Hela）和彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株（SUDHL4）購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640（美國Hyclone公司），FBS（美國Hyclone公司），PBS（美國Hyclone公司），0.25%EDTA胰蛋白酶（美國Gibco公司），DMSO（美國Sigma公司），TRIzol（日本TaKaRa公司），RNA反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公 司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），APS（美國Sigma-Aldrich公司），TEMED（美 國Sigma-Aldrich公 司），Tween20（北京鼎國生物科技有限公司），BSA（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人LAPTM5抗體、兔抗人β-actin抗體、鼠抗兔二抗（美國Cell signal公司），ECL發光試劑盒（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：利用蛋白提取試劑盒分別提取OVCAR3、Hela、SUDHL4細胞總蛋白，定量后行SDS-PAGE分離目的蛋白，轉移至PVDF膜，封閉20 min，加入LAPTM5一抗（稀釋比例1 ∶1 000）和 β-actin（稀釋比例1 ∶1 000）4 ℃過夜，加入二抗（1 ∶8 000）室溫孵育1 h，洗膜后天能凝膠成像系統下發光，拍照。以β-actin為內參。采用Image J軟件分析每個樣本蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比，以其比值作為目的蛋白的表達水平。重復實驗3次。

1.2.2 細胞轉染及分組：6孔板內接種OVCAR3細胞（5×105/孔），待細胞生長至70%融合時，按照lipofectamine3000說明書，分別應用空對照質粒以及LAPTM5沉默質粒轉染OVCAR3細胞，記為轉染空載體對照組（si-NC）和轉染LAPTM5沉默質粒組（si-LAPTM5），24～48 h后檢測沉默效率。

1.2.3 RNA的提取和實時定量PCR：應用TRIzol 試劑分別提取2組細胞總RNA，加入RNase R降解線狀RNA，RNA樣品稀釋后測定濃度。應用RNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，應用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒行實時定量PCR對反轉錄產物進行擴增。反應條件為預變性95 ℃ 2 min，95 ℃變性15 s，退火60 ℃ 1 min，40個循環。測定Ct值，以GAPDH為內參照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量。PCR引物序列見表1。重復實驗3次。

表1 相關引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細胞劃痕實驗：6孔板背面用直尺劃線，細胞轉染后繼續培養箱培養24 h，用0.25%胰蛋白酶消化制備成細胞懸液，細胞計數，鋪板（5×105/孔，盡量控制細胞密度隔夜鋪滿板底），次日用100 μL頭垂直劃線，棄去培養基，PBS反復清洗3次，繼續培養箱培養，分別于12 h、24 h倒置顯微鏡觀察、拍照。重復實驗3次。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗：Matrigel膠1 ∶8稀釋，包被Transwell小室。細胞轉染后繼續培養箱培養24 h，0.25%胰蛋白酶消化，然后用無血清培養基重懸細胞，計數，調整細胞濃度至5×105/mL。取100 μL細胞懸液加入Transwell小室，24孔板下室加入750 μL含20%血清的培養基。培養箱培養24 h，取出小室，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，棉簽擦去上層未侵襲細胞，PBS清洗3次，在顯微鏡下計數。重復實驗3次。

1.3 統計學分析

采用GraphPad軟件進行統計學分析，繪制統計圖，數據以表示，2組間差異采用獨立樣本t檢驗。采用Photoshop軟件處理圖片。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中的表達情況

LAPTM5在SUDHL4細胞中呈高表達，在Hela細胞中呈低表達，以這兩種細胞分別作為陽性和陰性對照進行Western blotting檢測，結果顯示，與Hela細胞相比，OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達水平上調，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；與SUDHL4細胞相比，OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達水平略降低，差異有統計學意義（P＜ 0.001），見圖1。以上結果證實，LAPTM5在OVCAR3細胞中表達上調。

圖1 OVCAR3細胞中LAPTM5蛋白表達情況Fig.1 Expression of LAPTM5 protein in OVCAR3 cells

2.2 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞遷移

對人卵巢腺癌OVCAR3細胞進行LAPTM5siRNA轉染，并利用PCR檢測轉染效率，結果顯示，LAPTM5siRNA能夠有效沉默OVCAR3細胞中LAPTM5的表達（0.139±0.338，P＜ 0.001），見圖2。隨后，通過細胞劃痕實驗檢測LAPTM5對OVCAR3細胞遷移能力的影響，結果顯示，與對照組（si-NC）相比，實驗組（si-LAPTM5）細胞遷移能力顯著下降（P＜ 0.01）。

圖2 轉染質粒后OVCAR3細胞遷移能力變化Fig.2 Changes in the migration ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.3 沉默LAPTM5抑制人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞侵襲

通過Transwell侵襲實驗進一步檢測LAPTM5對OVCAR3細胞侵襲能力的影響，結果顯示，與對照組（si-NC）相比，實驗組（si-LAPTM5）細胞侵襲能力下降（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 轉染質粒后OVCAR3細胞侵襲能力變化Fig.3 Changes in the invasion ability of OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

2.4 LAPTM5對人卵巢腺癌細胞OVCAR3中EMT相關標志物mRNA表達水平的影響

實時定量PCR結果顯示，實驗組（si-LAPTM5）細胞中EMT上皮標志物E-cadherin（3.469±0.618）mRNA表達水平較對照組上調（P＜ 0.05），間質標志物N-cadherin（0.603±0.032）和Vimentin（0.798±0.045）mRNA表達水平下調（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 轉染質粒后OVCAR3細胞EMT相關指標變化Fig.4 Changes in EMT-related indexes in OVCAR3 cells after transfection with a plasmid

3 討論

LAPTM5是LAPTM家族的一員，參與蛋白質由高爾基體向溶酶體的運輸過程，通過與E3泛素連接酶Nedd4相互作用，影響溶酶體和細胞質膜的分選［9-10］。文獻［11-12］報道，LAPTM4β-35在肝細胞癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達，且其表達水平與淋巴結及遠端轉移呈正相關。LAPTM5在食管癌和非小細胞肺癌患者中低表達［13］，有學者認為LAPTM5的失活可能與一些腫瘤的發生相關。Oncomine數據庫中，人類膀胱癌組織中LAPTM5基因表達顯著上調［14］。本研究結果顯示，LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中表達上調。

EMT過程中E-cadherin表達下調，N-cadherin、Vimentin等相關指標表達上調，細胞極性改變，細胞間黏附減少，失去正常形態，細胞遷移侵襲能力增強。EMT與卵巢癌腹膜轉移以及患者術后生存率密切相關［15-16］。本研究結果顯示，通過外源性沉默LAPTM5基因，人卵巢腺癌細胞OVCAR3細胞遷移、侵襲能力明顯下降，此外沉默LAPTM5會影響OVCAR3細胞EMT相關指標的變化，導致E-cadherinmRNA表達上調，N-cadherin、VimentinmRNA表達下調。CHEN等［14］研究顯示沉默LAPTM5能夠抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，同時發現LAPTM5的下調導致E-cadherin的增加和N-cadherin、β-catenin、Slug的減少，與本研究結果一致。本研究探討了LAPTM5對卵巢癌細胞EMT的影響，提示外源性沉默LAPTM5可能通過抑制卵巢癌細胞EMT進而抑制卵巢癌的發生和轉移。

綜上所述，LAPTM5在人卵巢腺癌細胞OVCAR3中表達上調，外源性沉默LAPTM5能夠抑制OVCAR3細胞EMT和遷移、侵襲能力。