紡織品中7種異噻唑啉酮類抗菌劑的同時測定

林君峰，王成云，白 爽，李成發，李麗霞，謝堂堂

（1.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東深圳 518010；2.深圳海關工業品檢測技術中心，廣東深圳 518067）

在紡織工業中，為了提高紡織品的抗菌性能，常使用抗菌劑進行抗菌整理。異噻唑啉酮是一類常用的抗菌整理劑，經其整理后，紡織品的抗菌性能得到極大提升［1-6］。例如，絲綢經異噻唑啉酮類抗菌劑整理后，抗菌性能得到極大改善。但是，部分異噻唑啉酮具有接觸致敏性，與皮膚接觸后會引發接觸性皮炎［7-16］；部分異噻唑啉酮具有細胞毒性和神經毒性，會損害人體和魚類的生殖系統［17-19］；職業性接觸異噻唑啉酮還可能導致中毒性肝病死亡［20］。因此各國紛紛立法限制其使用［21-23］，且限制使用的該類抗菌劑種類不斷增加。目前共有7 種異噻唑啉酮被列入管制目錄：2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、2-丁基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BBIT）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OI）、2-甲基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（MBIT）、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT）、4,5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOI）。紡織品、皮革、化妝品、涂料等樣品中的異噻唑啉酮類抗菌劑檢測已有大量文獻報道［24-34］，但測定對象均未完全涵蓋全部7 種限用異噻唑啉酮，建立的方法不能直接用于同時測定全部7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑。本實驗采用超聲萃取技術提取紡織品中的異噻唑啉酮，提取產物經處理后進行UPLC/MS-MS 分析，從而建立氣質聯用分析方法，能同時測定7 種異噻唑啉酮類抗菌劑。采用該方法對256 個市售紡織品進行測試，結果在6 個樣品中檢出OI，質量分數為336～10 169 mg/kg。

1 實驗

1.1 材料與儀器

織物：1#梭織真絲連衣裙、2#針織真絲女式長袖套頭衫、3#純棉女式短袖襯衫、4#平紋機織染色女式棉上衣、5#梭織亞麻女式長袖襯衫、6#梭織亞麻男式襯衫（6個陽性樣品中均被檢出含有OI［6］，市售）。

試劑：4,5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOI，99.8%，日本東京化成株式會社），2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OI，99.9%）、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT，99.2%）、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI，99.5%）（美國Sigma-Aldrich 公司），2-甲基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（MBIT，98.0%）、2-丁基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BBIT，95.0%）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI，99.0%）（德國Dr.Enrenstorfer GmbH公司），甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）。

儀器：QYB-3 自動制樣機（中山市啟元機械科技有限公司），AS3120 超聲波清洗器（美國Auto Science公司），RE-52AA 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），EVA50 氮吹儀（北京普力泰科儀器有限公司），0.45 μm 濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司），6495 Triple Quad UPLC/MS-MS 超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 混合標準工作溶液的配制

用甲醇配制混合標準儲備液（各組分質量濃度均為200 μg/L），用甲醇逐級稀釋至各組分質量濃度為100.0、40.0、20.0、10.0、4.0、2.0、1.0、0.4、0.2 μg/L，得到系列質量濃度的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

樣品前處理參照文獻［6，34］進行：將待測樣品切割成5 mm×5 mm 的小塊，混勻，稱取約1 g 樣品放入35 mL 玻璃反應瓶中，加入20 mL 甲醇，在45 ℃下超聲萃取20min，過濾，濾液收集到200 mL 雞心瓶中；殘渣用20 mL 甲醇再次進行超聲萃取，合并萃取液。在旋轉蒸發儀中將萃取液于真空下旋轉蒸發至近干，再轉移至氮吹儀中用干燥氮氣緩慢吹干［6，35-38］。用1 mL 甲醇溶解殘留物，所得溶液用0.45 μm 濾膜過濾，濾液供測試用。

1.4 測試

UPLC/MS-MS：采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀進行測試。

2 結果與討論

2.1 超聲萃取條件的優化

影響超聲萃取效率的因素主要有萃取溶劑種類及體積、萃取方式、萃取時間、萃取溫度［6，36-39］。首先以甲醇作為萃取溶劑，單獨考察萃取時間、萃取溶劑體積、萃取溫度對萃取量的影響（對6 個陽性樣品各超聲萃取1 次，觀察每個樣品的萃取量和總萃取量變化）。由表1～表3 可知，萃取量和總萃取量均隨著萃取時間的延長、萃取溶劑體積的增加、萃取溫度的升高而提升并達到最大值；達到最大值后，繼續延長萃取時間、增加萃取溶劑體積和升高萃取溫度，萃取量反而下降。萃取時間、萃取溶劑體積、萃取溫度同時影響萃取量和總萃取量，可通過正交實驗來考察其綜合影響。表4 為3 因素3 水平正交實驗的9 個實驗條件，在給定的萃取條件下，選擇甲醇作為萃取溶劑進行1 次超聲萃取，6 個陽性樣品的萃取量和總萃取量也列于其中。針對6 個陽性樣品，根據表4 中的萃取量數據分別計算萃取時間A、萃取溶劑體積B、萃取溫度C的k值、R值，以確定優化方案。5#、6#樣品的優化方案分別為A2B2C1、A3B2C3，其余4 個樣品和總萃取量的優化方案均為A2B2C3。綜合考慮，最終確定的優化方案為A2B2C3。在此條件下，以甲醇作為萃取溶劑，對6 個陽性樣品進行連續3 次超聲萃取，計算總萃取量和每次萃取量占總萃取量的百分比。實驗結果表明，對于1#、2#、3#、4#、5#、6#樣品，第1 次萃取量分別占總萃取量的91.86%、93.17%、94.57%、92.68%、95.83%、93.42%，第2 次萃取量分別占總萃取量的8.14%、6.83%、5.43%、7.32%、4.17%、6.58%，第3 次萃取時均未檢出OI。因此采用連續2次超聲萃取的方式提取紡織品中的異噻唑啉酮類抗菌劑。

表1 萃取量隨萃取時間的變化

表2 萃取量隨萃取溶劑體積的變化

表3 萃取量隨萃取溫度的變化

表4 超聲萃取正交實驗表

在上述萃取條件下，分別以表5 中所列出的11種常見溶劑作為萃取溶劑［37］，超聲萃取6 個陽性樣品中的OI。實驗結果表明，對于6個陽性樣品，甲醇的萃取量均最大。因此，超聲萃取條件最終確定以甲醇作為萃取溶劑，進行連續2 次超聲萃取，萃取溫度45 ℃，萃取時間20 min，萃取溶劑體積20 mL。

表5 不同溶劑的萃取效果

2.2 分析條件的優化

2.2.1 質譜條件

進行質譜分析時，毛細管電壓為+3 500 V，碰撞氣為高純氮氣（純度大于99.999%），鞘氣和吹掃氣均為氮氣，流速均為11 L/min，鞘氣和吹掃氣溫度分別為350、250 ℃。在此條件下，對各組分質量濃度均為200 mg/L 的混合標準工作溶液進行分析。根據化合物的分子結構可知，異噻唑啉酮類抗菌劑在正離子模式下有比較好的響應，而且經過ESI 電離生成的特征分子離子峰均為［M+H］+，將其選為母離子峰，確定MI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 和DCOI 的準分子離子（母離子）分別為m/z=116.02、149.98、152.02、166.03、208.08、214.13、282.05。在碰撞電壓分別為10、30、50、70 V 條件下，用高純氮氣對上述母離子進行碰撞產生碎片離子。母離子與其產生的1 個子離子可以組成1個離子對。對于每個母離子，均選擇豐度較高的4個離子對，利用Optimizer 優化軟件進一步細致優化碰撞能量。細致優化時，碰撞能量從1 V 逐漸增大至79 V，增長步長為2 V。觀察不同碰撞能量下各離子對的豐度變化，豐度最大時的電壓就是優化后的碰撞能量。各離子對的駐留時間由儀器根據保留時間（tR）以及保留時間變化范圍（ΔtR）自動計算，池加速電壓均為2 V，優化后的參數見表6。

表6 7 種異噻唑啉酮類抗菌劑的動態MRM 條件

2.2.2 色譜條件

異噻唑啉酮類化合物都屬于極性比較強的化合物，因此本實驗采用C18類型的色譜柱對其進行分離，比較不同型號的C18色譜柱的分離效果，最終采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）進行色譜分離。在確定色譜柱后，分別考察甲醇/水溶液流動相和乙腈/水溶液流動相的分離效果。結果表明，采用乙腈/水溶液作為流動相時基線平穩，譜峰峰形較好，峰面積和保留時間的重復性較好。為進一步改善質譜信號響應，分別在水相中添加0.1%甲酸、0.01 mol/L 乙酸銨。結果表明，當添加0.1%甲酸時，色譜峰之間能夠完全分離，而且響應也比較高。因此，最終選擇的流動相為乙腈/水溶液（含0.1%甲酸）。在此流動相下，改變流速、柱溫、洗脫梯度，觀察不同色譜條件下各組分的分離效果。結果發現，當柱溫較高時，柱壓明顯下降，但分離度也下降；流速較大時，各目標分析物的保留時間變短，譜峰峰形變窄，柱壓上升，分離度下降［40］。色譜分離條件最終優化為：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相A 為水（含0.1%甲酸），B為乙腈；當洗脫梯度為0 min 時，流動相為90%A/10%B，8.00 min 時線性遞變為10%A/90%B 并保持至9.00 min，9.01 min 時流動相變為90%A/10%B 并保持至12.00 min；流速為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃。

在2.2 的條件下對7 種異噻唑啉酮類抗菌劑混合標準溶液進行分析，得到的UPLC/MS-MS 圖如圖1 所示。圖1 中，各組分的譜峰之間完全分離，譜峰峰形尖銳，對稱性好。

圖1 混合標準溶液的UPLC/MS-MS 圖

2.3 方法的回收率與精密度

回收率和精密度實驗見表7。

表7 回收率和精密度實驗

以不含目標分析物的襯布作為空白樣品，采用空白樣品加標回收的方法來確定方法的回收率和精密度［41］，所用襯布分別為白棉襯布、亞麻襯布、真絲襯布以及滌綸襯布。在空白樣品中分別添加3 個不同質量分數的混合標準溶液（1.0、4.0、20.0 μg/kg），制備添加回收實驗測試樣［36-41］，每個質量分數水平各制備6 份平行樣，按本實驗建立的方法進行測試，再計算方法的加標平均回收率和相對標準偏差（RSD，n=6）［37］。由表7 可以看出，7 種目標分析物的加標平均回收率為80.25%～96.52%，相對標準偏差為3.25%～14.59%。

2.4 方法的線性關系和檢出限

應用本實驗建立的方法對系列質量濃度的混合標準工作溶液進行測試，確定各混合標準工作溶液中各化合物的峰面積，用峰面積對質量濃度作圖［36］，結果發現，對于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，在一定質量濃度范圍內，峰面積與其質量濃度線性相關。表8給出了7 種異噻唑啉酮類抗菌劑的線性關系。按10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量下限（LOQs），7種異噻唑啉酮類抗菌劑的定量下限均為0.1 μg/kg。

表8 線性關系和定量下限

2.5 實際樣品測試

利用本實驗建立的方法對256 個市售紡織品進行測試，結果在6 個樣品中檢測到了OI，這6 個樣品分別是梭織真絲連衣裙、針織真絲女式長袖套頭衫、純棉女式短袖襯衫、平紋機織染色女式棉上衣、梭織亞麻女式長袖襯衫以及梭織亞麻男式襯衫［6］，其中OI 的檢出量分別為6 694、718、829、10 169、336、8 796 mg/kg。歐盟法規要求紡織品中OI 的質量分數不得超過10 mg/kg，這6 個樣品的OI 檢出量均遠遠超過歐盟法規允許的限量水平，應引起重視。圖2 是純棉女式短袖襯衫的UPLC/MS-MS 圖，在tR=6.830 min處有1 個尖銳譜峰，該保留時間與OI 標準品的保留時間（tR=6.830 min）一致。

圖2 純棉女式短袖襯衫的UPLC/MS-MS 圖

3 結論

建立了UPLC/MS-MS 分析方法，能同時測定紡織品中的7 種異噻唑啉酮類抗菌劑，該方法簡便快捷，靈敏度高，定量下限低至0.1 μg/kg，遠低于歐盟法規的限量水平，完全可以滿足紡織品中異噻唑啉酮類抗菌劑的日常檢測工作要求。應用該方法對市售紡織品進行測試，結果在部分樣品中檢出了OI，其質量分數為336～10 169 mg/kg，遠高于歐盟允許限量水平（10 mg/kg），應引起高度重視。