HLA高分辨等位基因多態性及單倍體與廣西漢族終末期腎病易感性的相關性分析*

李海濱，孫煦勇，裴永峰**，黃程新，覃音紅，董建輝，楊 錦，王洪良，文 寧，吳基華，廖吉祥，李美思

(1.廣西醫科大學第二附屬醫院移植醫學中心，廣西器官捐獻與移植研究重點實驗室，廣西移植醫學工程技術研究中心，廣西南寧 530007；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院器官移植科，廣西移植醫學工程技術研究中心，廣西移植醫學重點實驗室，廣西南寧 530021)

人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)，又稱移植抗原，是目前所知人體最復雜的多態系統，在機體免疫系統與疾病的應答時起關鍵作用，也是影響機體免疫耐受和排斥時非常重要的一個抗原[1]。截至2021年11月，被世界衛生組織HLA系統因子命名委員會命名的等位基因數分別為7 114個(HLA-A)、8 464個(HLA-B)和3 045個(HLA-DRB1)，HLA等位基因共有31 675個[2]。不同地域、民族和疾病人群HLA的等位基因和單倍型頻率等具有各自的特點[3,4]。

研究發現，中國人群慢性腎病的患病率約為10.8%，部分患者最終發展成終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)，且ESRD的患者在逐年增加[5]。目前，腎移植被認為是ESRD患者最好的治療方法，可明顯提高患者的生活質量和生存率[6,7]。研究發現腎移植時供體和受體的HLA分型結果越吻合，受體腎的移植效果越好[8]，尤其是可直接激活受體的HLA-Ⅱ類分子，是誘導移植排斥的重要靶抗原[9]。HLA與腎疾病相關性的研究始于20世紀，發現許多HLA等位基因與ESRD的發生具有關聯性，且在不同地域和人種中，其易感或保護基因具有差異[10-12]。

廣西總人口約5 000萬，其中，漢族人口約3 100萬(數據來源于廣西第七次全國人口普查主要數據)，遠遠大于壯族人口。本研究采用聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotides,PCR-SSO)技術，對本移植醫學中心和中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院器官移植科的578例漢族ESRD患者進行HLA基因中、高分辨分型，并與中國造血干細胞捐獻者資料庫廣西管理中心的漢族捐獻者相應的基因頻率及單倍型頻率等進行比較，為深入了解HLA和ESRD患者的發病機理及相關性研究奠定基礎，同時為器官移植配型篩選等提供數據支持和依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

ESRD組：從本移植醫學中心實驗室和中國人民解放軍第九二三醫院器官移植科實驗室做HLA分型檢測的等待移植患者5 160例(2014年-2021年9月)中，隨機選取廣西本地漢族終末期腎病患者578例，彼此間無血緣關系。其中男性325例，年齡13-77歲，中位年齡41歲；女性253例，年齡12-68歲，中位年齡39歲。對照組：從中國造血干細胞捐獻者資料庫廣西管理中心約5 000例的捐獻者(2011-2015年)中，隨機選取廣西本地漢族1 644例，其中男性858名，女性786名，年齡18-50歲[13]。HLA分型檢測都獲得了實驗組研究者的知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

DNA提取試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit，荷蘭QIAGEN，批號：51104和51106)；HLA-A、B、DRB1、SSO基因分型檢測試劑盒(LIFECODES HLA-SSO TYPING KITS，美國Gen-Probe Transplant Diagnostics，批號LOT-A：628410，LOT-Ae：628459，LOT-B：628510，LOT-Be：628559，LOT-DRB1：628751，LOT-DRB1 e：628759)；9600型PCR擴增儀(美國Proflex)；核酸蛋白測定儀(Multiskan sky，美國Thermo)；多功能流式點陣儀(Luminex-200，美國Luminex)，干式恒溫器(H1型，珠海黑馬醫學儀器有限公司)。

1.3 方法

ESRD組采集2 mL或5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血，嚴格按試劑盒說明書提取DNA，DNA濃度調整為30-100 ng/μL，A260/A280為1.65-1.90。采用LIFECODES HLA-SSO TYPING KITS對ESRD的靜脈血標本進行HLA-A、B、DRB1共3個位點的基因分型，所有的ESRD患者和相應的供體在移植前，都進行微量淋巴細胞毒性實驗。如果對ESRD患者的分型結果有疑問，則再次用其靜脈血提取DNA，然后用LIFECODES HLA-SSO試劑復核。

1.4 統計分析

ESRD組HLA等位基因的頻率采用直接計算法，應用Arlequin 3.5.2.2軟件對ESRD組的3個位點作Ewens-Watterson檢驗和Hardy-Weinberg(HWE)檢驗，ESRD組的單倍體頻率利用該軟件的最大期望(EM)算法[14]獲得。ESRD組與對照組等位基因及單倍型頻率的比較，采用SPSS 19.0軟件的χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義，并計算優勢比(Odds Ratio,OR)和95%可信區間(Confidence Interval,CI)。

2 結果與分析

2.1 Ewens-Watterson檢驗

ESRD組和對照組人群Ewens-Watterson檢驗的結果表明，兩組人群的3個位點都符合中性選擇(P>0.05)。

2.2 HWE檢驗

HWE檢驗結果表明，ESRD組中3個位點都符合HWE遺傳平衡(P>0.05)，而對照組中的3個位點偏離了HWE遺傳平衡(P<0.05)。

2.3 HLA-A等位基因頻率比較

ESRD組檢出29個HLA-A等位基因，頻率在前5位的基因分別是A*11:01(34.86%)、A*24:02(14.45%)、A*02:03(10.73%)、A*02:07(9.95%)和A*33:03(9.17%)。對照組基因頻率最高的也是這5個基因，只是頻率與ESRD組不同。與對照組相比，ESRD組A*11:01基因和A*02:01基因頻率高于對照組(P<0.001)，A*11:02基因、A*30:01基因和A*32:01基因頻率低于對照組(P<0.05)，具體見表1。

表1 ESRD組和對照組HLA-A等位基因頻率的比較Table 1 Comparison of HLA-A allele frequency between ESRD group and control group

2.4 HLA-B等位基因頻率比較

ESRD組檢出57個HLA-B等位基因，頻率在前5位的基因分別是B*46:01(13.32%)、B*40:01(12.80%)、B*15:02(11.42%)、B*13:01(10.64%)和B*58:01(8.65%)。對照組基因頻率最高的也是這5個基因，但頻率不同。與對照組相比，ESRD組B*13:01基因頻率高于對照組(P<0.05)，B*13:02基因和B*07:02基因頻率低于對照組(P<0.05)，具體見表2。

表2 ESRD組和對照組HLA-B等位基因頻率的比較Table 2 Comparison of HLA-B allele frequency between ESRD group and control group

續表Continued table

2.5 HLA-DRB1等位基因頻率比較

ESRD組檢出34個HLA-DRB1等位基因，頻率在前5位的基因分別是DRB1*15:01(12.02%)、DRB1*12:02(11.25%)、DRB1*16:02(9.52%)、DRB1*09:01(8.82%)和DRB1*04:05(8.39%)。對照組基因頻率最高的5個基因有3個與ESRD組相同。與對照組相比，ESRD組DRB1*12:02、DRB1*04:05、DRB1*14:54和DRB1*11:01基因頻率高于對照組(P<0.05)，DRB1*07:01和DRB1*13:02基因頻率低于對照組(P<0.05)，具體見表3。

表3 ESRD組和對照組HLA-DRB1等位基因頻率的比較Table 3 Comparison of HLA-DRB1 allele frequency between ESRD group and control group

2.6 三位點單倍型頻率的比較

Arlequin軟件分析顯示，ESRD組總共有489個三位點單倍型，只有23.45%的單倍型頻率大于1%，最常見的單倍型是A*33:03-B*58:01-DRB1*03:01，這也是對照組最常見的單倍型。兩組頻率前20位的三位點單倍型頻率相比，A*11:01-B*15:02-DRB1*12:02、A*11:01-B*15:02-DRB1*15:01和A*11:01-B*40:01-DRB1*04:05有統計學意義(P<0.05)，具體見表4。

表4 ESRD組前20位的三位點單倍型頻率與對照組的比較Table 4 Comparison of three-locus haplotype frequencies at the top 20 sites in the ESRD group with those in the control group

2.7 兩位點單倍型頻率的比較

Arlequin軟件分析顯示，ESRD組分別得到了216，274和188個兩位點單倍型，其頻率低于1%的分別占總頻率的40.42%、52.81%和39.59%。各頻率前20位的兩位點單倍型見表5，頻率最高的分別是A*11:01-B*15:02(7.72%)、B*58:01-DRB1*03:01(6.39%)和A*11:01-DRB1*12:02(5.46%)。ESRD組和對照組的兩位點單倍型頻率比較，A*11:01-B*55:02、B*15:02-DRB1*12:02、B*40:01-DRB1*11:01、B*46:01-DRB1*14:01、A*11:01-DRB1*04:05和A*11:01-DRB1*11:01有統計學意義(P<0.05)。

表5 ESRD組前20位的兩位點單倍型頻率與對照組的比較Table 5 Comparison of two-locus haplotype frequencies at the top 20 sites in the ESRD group with those in the control group

續表Continued table

3 討論

HLA等位基因的多態性可以體現在地區和人種的差異上[3,4]，而且HLA部分等位基因和疾病具有遺傳相關性[1,6]。目前疾病與HLA相關性的研究，是通過對比某種疾病的患者和健康人群一些HLA特定等位基因及單倍型等的頻率，經過統計分析，判別該基因與疾病的易感性或保護性。前期研究發現，影響ESRD患者的重要分子之一可能是HLA，因為HLA部分等位基因與腎臟疾病的移植免疫密切相關[8,9]。廣西漢族的人口目前仍然位居廣西首位，因此，探究廣西漢族ESRD患者HLA等位基因的分布頻率和特點，并和廣西健康漢族人群作對比分析，對ESRD患者的診斷、預后及治療可能會有較深的基礎研究和臨床應用價值。

本研究首先對廣西漢族ESRD患者進行了HLA-A、B和DRB1位點的Ewens-Watterson檢驗和HWE檢驗。Ewens-Watterson檢驗發現，廣西漢族ESRD患者HLA-A、B和DRB1位點的數據均符合中性選擇，反映出ESRD患者HLA的多態性主要是由基因突變和漂移造成的；HWE檢驗發現，廣西漢族ESRD患者的3個位點都符合HWE遺傳平衡，反映出ESRD患者在自然選擇、自由婚配和沒有新的突變時，HLA等位基因的頻率基本沒有變化[15]，符合遺傳學的基本規律。

HLA等位基因和ESRD患者的關聯性研究很多，但目前大部分研究是以HLA低分辨方法進行。南京醫科大第一附屬醫院研究發現，HLA-A*11:01、A*31:01、B*15:01、B*55:02、B*39:05、DRB1*03:01、DRB1*04:03、DRB1*04:04、DRB1*04:05、DRB1*11:01和DRB1*12:02是江蘇漢族ESRD患者的易感基因，而DRB1*15:01可能是該類患者的保護基因[10]；HLA-A*24和B*35是印度尼西亞人ESRD患者的保護基因[16]；B*50是巴基斯坦人ESRD患者的易感基因，HLA-B*40、DRB1*13和DRB1*12是該類患者的保護基因[17]；HLA-DRB1*15是重慶地區慢性腎功能衰竭患者的易感基因[18]；HLA-DRB1*04、DRB1*12和DRB1*14是河北漢族ESRD患者的易感基因,而DRB1*09是該類患者的保護基因[19]；HLA-B*56和DRB1*4可能是廣西壯族慢性腎衰竭患者的易感基因，HLA-A*26、B*62和DRB1*08可能是該類患者的保護基因[20]；廣州南方醫院移植中心發現，HLA-A*24、B*54、B*55、B*60和DRB1*04是廣東地區ESRD患者的易感基因[21]；HLA-B*15和B*18是沙特阿拉伯ESRD患者的易感基因，HLA-A*26、B*39和B*50是該類患者的保護基因[22]。上述結果并不完全一致，是否與人群及樣本量大小相關，需要進一步驗證。

廣西漢族ESRD患者共發現HLA-A等位基因29個，B等位基因57個和DRB1等位基因34個。其中A*11:01(34.86%)、A*24:02(14.45%)、A*02:03(10.73%)、B*46:01(13.32%)、B*40:01(12.80%)、B*15:02(11.42%)、B*13:01(10.64%)、DRB1*15:01(12.02%)和DRB1*12:02(11.25%)等9個基因的頻率都大于10%，且這些高頻率的等位基因對于廣西漢族正常人也都屬于高頻率，因此具有這些等位基因的患者更容易找到合適的移植供體。但也發現，HLA-A*11:01、DRB1*04:05和DRB1*11:01是廣西漢族ESRD患者的3個易感基因，這與江蘇漢族ESRD患者的易感基因相同[10],同時，DRB1*04也是廣東人ESRD患者的易感基因[21],DRB1*11也是臺灣ESRD患者的易感基因[23]；DRB1*12:02是廣西漢族ESRD患者的易感基因之一，而DRB1*12也是大連漢族ESRD患者的易感基因[11]。文獻報道，HLA-A和HLA-C位點與移植后受者存活率，以及急慢性排斥反應的發生具有相關性[24]，在廣西漢族ESRD患者中檢出了2個HLA-A易感基因(A*11:01和A*02:01)和3個保護基因(A*11:02、A*30:01和A*32:01)，這5個基因是否與受者存活率及排斥反應相關，需要更多臨床移植后的數據進行驗證。

許多疾病與HLA的連鎖不平衡也有相關性[10,25]，目前常用單倍型來反映HLA的連鎖不平衡。本研究發現，廣西漢族ESRD患者頻率最高的三位點單倍型是A*33:03-B*58:01-DRB1*03:01(5.09%)，這也是廣西漢族健康人群及廣西壯族健康人群頻率最高的單倍型[4,13]，因此具有該單倍型的患者，在廣西相對比較容易找到合適的移植供體。與對照組相比，廣西漢族ESRD患者人群有3條三位點單倍型(A*11:01-B*15:02-DRB1*12:02、A*11:01-B*15:02-DRB1*15:01和A*11:01-B*40:01-DRB1*04:05)和6條兩位點單倍型(A*11:01-B*55:02、B*15:02-DRB1*12:02、B*40:01-DRB1*11:01、B*46:01-DRB1*14:01、A*11:01-DRB1*04:05和A*11:01-DRB1*11:01)有統計學意義，這些單倍型可以認為是廣西漢族ESRD患者的易感單倍型，但也就意味著帶有該單倍型的ESRD患者在廣西相對比較難找到匹配的供體。相對于HLA位點的錯配，受者的長期存活率受單倍型的錯配影響更大，說明HLA等位基因也許不是單獨發揮作用，推測是等位基因在單倍型里相互作用后才整體發揮作用[26,27]，需要后續進一步研究。

本研究的廣西漢族ESRD患者只有部分易感基因與文獻報道一致，其他易感或保護基因則與文獻報道差別較大。分析原因在于，首先，HLA系統的遺傳多態性及連鎖不平衡，導致其等位基因在地域和民族上區別較大[3,4]；其次，不同研究標本的抽樣誤差和統計方法對結果也有影響[11,28]；再次，目前進行的ESRD與HLA相關性的研究，絕大部分采用HLA低分辨方法，這容易導致HLA抗原和等位基因的漏檢；或者是不同ESRD患者的原發基礎疾病不同或環境的誘發因素導致[11]。HLA與ESRD患者的相關性機理，用以前常見的連鎖不平衡學說、受體學說或免疫逃逸等學說[29]來解釋，都只能從不同的側面說明兩者部分的關系，并未完全闡明其相關機制。目前有學者認為，腎臟疾病可能由淋巴器官或腎臟中HLA的作用引起，腎細胞或腎單核吞噬細胞表達的不同HLA同種異體，可能在機制上與腎臟疾病有關[30]，需要后續進一步研究。

本移植中心的HLA實驗室從2019年4月至2021年12月已經完成HLA分型檢測的標本約2 000份，其中90%以上是ESRD患者標本。在有大量的臨床標本來源的前提下，需要對ESRD患者的病因進行詳細分類，并進行下一步研究。隨著HLA二代測序方法在各個移植實驗室的應用逐漸開展[31]，以及全基因組關聯分析(Genome-wide Association Study,GWAS)方法在疾病易感相關性研究方面的應用[32,33]，是否可以將這2種方法應用于廣西漢族ESRD患者與HLA多態性的關聯性分析，需要更多大樣本數據的收集、病因分類等進一步綜合研究。

4 結論

本研究首次對HLA高分辨等位基因多態性及單倍體與廣西漢族終末期腎病易感性的相關性進行了探討，發現廣西漢族ESRD患者HLA-A、B和DRB1高頻率的等位基因和單倍型與廣西漢族健康人基本相同，其中HLA-A*11:01、A*02:01、B*13:01、DRB1*12:02、DRB1*04:05、DRB1*14:54和DRB1*11:01可能與廣西漢族ESRD高發病風險相關；HLA-A*11:02、A*30:01、A*32:01、B*13:02、B*07:02、DRB1*07:01和DRB1*13:02可能與廣西漢族ESRD低發病風險相關。研究結果為廣西漢族ESRD患者尋找臨床移植供體時提供了HLA等位基因的數據參考，同時為后續HLA與ESRD患者發病的機理研究提供了參考，也為臨床ESRD患者的早期基因診斷和防治研究提供了有益的探索。