結直腸癌細胞過表達tricellulin促進人臍靜脈內皮細胞侵襲轉移*

彭 鵬，張金秀，李夢詩，覃蒙斌，孫 娟，吳晴茹，程若溪，劉詩權，黃杰安

(廣西醫科大學第二附屬醫院消化內科，廣西南寧 530007)

結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種常見的消化道腫瘤。在全球人類腫瘤中，結直腸癌的總發病率排名第三，死亡率排名第二。雖然多種治療手段可應用于結直腸癌的治療，但是其預后仍然不理想，尤其是在疾病晚期[1]。因此，研究結直腸癌侵襲轉移的分子機制和尋找更有效的生物分子標記物具有重要意義。Tricellulin，也稱為TRIC、MARVELD2，是2005年科學家通過免疫電鏡技術首次發現的存在于三細胞連接處的緊密連接蛋白，是第一個被發現的分布于三細胞連接處的分子[2]。它為細胞最終構成各種立體結構提供支點，是構成和維持細胞間黏附功能的重要結構[3]。近年來的研究發現，tricellulin與腫瘤的發生發展、侵襲轉移密切相關，有可能成為評估腫瘤進展和治療的新靶點[4,5]。研究發現，tricellulin在結直腸癌組織中高表達，且與結直腸癌腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關[6]，但是其中的分子機制尚不清楚。血管生成是腫瘤侵襲轉移的重要因素之一。血管內皮細胞是構成血管內膜的基本元素，在血管新生過程中起決定作用。基質金屬蛋白酶(MMPs)在介導腫瘤血管新生、轉移和侵襲等過程中發揮重要作用。因此，研究tricellulin和內皮細胞的聯系對于探索其與腫瘤血管生成、侵襲轉移具有重要作用。本研究通過慢病毒轉染結直腸癌細胞HCT116過表達tricellulin，檢測轉染前后結直腸癌細胞MMP2、MMP7的表達及侵襲能力的變化，檢測轉染前后細胞上清液對人臍靜脈內皮細胞HUVEC侵襲能力的影響，以探索tricellulin影響結直腸癌侵襲轉移能力的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與慢病毒載體

人結直腸癌細胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結腸黏膜上皮細胞系NCM460，人臍靜脈內皮細胞HUVEC均購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞資源中心。根據tricellulin基因(GeneID：NM_001038603.2)設計的重組慢病毒過表達載體LV-tricellulin和空載體LV-GFP(陰性對照)購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

CO2恒溫細胞培養箱購自美國賽默飛世爾科技公司；移液器購自德國epppendorf公司；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；垂直電泳儀、濕轉轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外熒光成像儀購自美國LI-COR公司。

1.1.3 主要材料與試劑

Transwell小室、細胞培養皿及24孔細胞培養板購自美國Corning公司；10%胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司；結晶紫購自大連美侖生物技術有限公司；tricellulin兔抗人多克隆抗體購自美國賽默飛世爾科技公司；GAPDH抗體購自美國Proteintech Group公司；IRDye?680RD Goat anti-Rabbit購自美國LI-COR公司；硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司；Matrigel膠購自美國B&D公司；嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司；MMP2、MMP7 ELISA kits購于美國CLOUD-CLONE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

人結直腸癌細胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結腸黏膜上皮細胞系NCM460以及人臍靜脈內皮細胞HUVEC分別用含有10%胎牛血清DMEM培養基放置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 慢病毒轉染

選取處于對數生長期的HCT116細胞進行慢病毒轉染，待細胞鋪滿孔50%時，按照說明書將編碼人tricellulin的過表達慢病毒載體(TRIC-OE)及空載慢病毒(NC)分別轉染HCT116細胞，運用嘌呤霉素篩選后獲得穩定轉染細胞株。采用western blot驗證轉染效率。

1.2.3 Western blot

將40 μg細胞蛋白和上樣緩沖液混合并變性后，上樣在12%分離膠/5%積層膠上進行SDS-PAGE。應用電轉移將電泳分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，濾膜經5%脫脂奶粉-TBS溶液于室溫封閉1 h后，一抗孵育過夜。濾膜經TBST緩沖液清洗3次后，再與熒光二抗于室溫孵育1 h。濾膜經TBST緩沖液清洗3次后，應用Odyssey 雙色紅外熒光掃描成像系統顯影。GAPDH設置為內參對照。

1.2.4 Transwell小室檢測HCT116細胞侵襲能力

將Matrigel膠用無血清DMEM培養基按照1∶8的比例稀釋，吸取50 μL鋪于上室，將鋪好的基質膠放置到4℃冰箱包被過夜。分別將TRIC-OE、NC組細胞懸液種在上室，下室加入含20%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的DMEM培養基，放置到培養箱中培養24 h。使用適量甲醇將小室底膜上的細胞固定后置于0.1%結晶紫中染色。清洗后倒置風干，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照計數。

1.2.5 Transwell小室檢測TRIC-OE上清液對HUVEC細胞侵襲能力的影響

TRIC-OE在10 cm培養皿中長至約80%匯合度時，換成6 mL新鮮的完全培養基。24 h后收集細胞培養上清液，3 000 r/min離心5 min后，將上清液轉移到新的15 mL離心管中。使用TRIC-OE上清液配制條件培養基(TRIC-OE-CM)，上清液∶20%FBS=8∶2。當HUVEC細胞達到約60%匯合度時，將培養基換成條件培養基繼續培養，48 h后消化、離心并收集HUVEC細胞。鋪膠方法同1.2.4節，將HUVEC細胞懸液種在上室，使用無血清培養基培養，下室加入培養條件培養基。培養24 h后，固定、染色、拍照方法同1.2.4節。

1.2.6 ELISA法檢測MMP2、MMP7的表達

各組細胞培養24 h后收集細胞上清液。根據ELISA試劑盒操作說明檢測TRIC-OE、NC兩組細胞上清液中MMP2、MMP7的表達含量。根據標準品濃度及A 值繪制標準曲線，計算每孔待測品濃度。

1.3 統計學方法

2 結果與分析

2.1 Tricellulin在人結直腸癌細胞系中的表達

Tricellulin蛋白在人結直腸癌細胞系HCT116、SW620、HCT8的表達量均高于人結腸黏膜上皮細胞系NCM460(圖1)，說明tricellulin在人結直腸癌細胞中高表達。選擇中等量表達內源性tricellulin蛋白及侵襲能力中等的HCT116細胞株，以進行下一步實驗。

圖1 Tricellulin在人結直腸癌細胞系及人結腸黏膜上皮細胞系的表達Fig.1 Expression of tricellulin in human colorectal cancer cell lines and human colonic mucosal epithelial cell lines

2.2 過表達tricellulin的鑒定

過表達慢病毒轉染結直腸癌細胞HCT116，經過篩選后獲得穩定過表達tricellulin的細胞株，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達大于70%(圖2)。提取總蛋白進行western blot實驗，以GAPDH為參照基因，結果如圖3。Western blot的驗證實驗結果說明，穩定過表達tricellulin 的HCT116細胞株成功構建，此細胞株可用于后續實驗。

圖2 慢病毒轉染tricellulin (TRIC-OE)與陰性對照組細胞(NC)內綠色熒光蛋白表達(250×)Fig.2 Green fluorescent protein expression in lentivirus-transfected tricellulin (TRIC-OE) and negative control cells (NC)(250×)

**indicates significant difference at P<0.01

2.3 過表達tricellulin對人結直腸癌細胞侵襲能力的影響

通過Transwell小室實驗檢測各組細胞對人結直腸癌細胞的侵襲能力的影響，結果顯示，與NC組相比，TRIC-OE組的侵襲細胞數量明顯增加(圖4，P<0.01)，說明過表達tricellulin可增強人結直腸癌細胞的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

2.4 過表達tricellulin細胞上清液對HUVEC細胞侵襲能力的影響

通過Transwell小室實驗檢測各組細胞上清液對HUVEC細胞的侵襲能力的影響。與NC組相比，使用TRIC-OE上清液配制條件培養基(TRIC-OE-CM組)可使HUVEC細胞侵襲數量明顯增加(圖5，P<0.01)，說明過表達tricellulin人結直腸癌細胞上清液可增強HUVEC細胞的侵襲能力。

2.5 過表達tricellulin細胞上清液對MMP2、MMP7表達的影響

ELISA法檢測各組細胞上清液中MMP2、MMP7的表達，結果顯示TRIC-OE組中MMP2、MMP7的含量明顯升高(圖6，P<0.01)，說明tricellulin可能通過MMP2、MMP7影響HUVEC的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

**indicates significant difference at P<0.01

3 討論

雖然多種治療手段可應用于結直腸癌的治療，如手術、放化療、免疫治療、靶向治療等，但是結直腸癌的預后仍不佳[7]。在所有腫瘤中，結直腸癌的轉移率位居第三，是消化內科臨床患者的常見死亡原因。目前結直腸癌侵襲轉移的分子機制尚未完全闡明。腸上皮屏障由單層細胞和細胞間連接組成，細胞間連接包括緊密連接、黏附連接、橋粒、縫隙連接[8]。越來越多的研究表明，緊密連接蛋白在腫瘤的發生、侵襲轉移中扮演著重要角色[9-11]。Tricellulin作為緊密連接蛋白中的一員，其主要表達在三細胞連接處。筆者在前期研究工作中發現，tricellulin在結直腸癌組織中高表達，且與結直腸癌腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關[6]，但是其異常表達對腫瘤的生物學行為產生影響，目前作用機制尚不明確。

腫瘤的侵襲轉移是一個復雜的、多階段的過程[12]。內皮細胞構成了血管的內層，參與了血管生成的關鍵環節，是腫瘤治療的重要靶點之一[13]。血管生成與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關。腫瘤細胞生長必須依賴血管的生成來提供必要的營養物質和氧氣[14]，此外，腫瘤細胞可分泌蛋白降解酶類(如MMPs),降解細胞外基質(ECM)后形成腫瘤細胞移動的通道，腫瘤細胞穿透ECM，并穿透血管壁的基底膜進入血液循環，從而實現遠處轉移[15]。MMPs作為目前已知能降解細胞外基質的重要酶類，在介導腫瘤血管新生、轉移和侵襲等過程中發揮重要作用[16]。本研究通過基因工程技術調控tricellulin的表達發現，過表達tricellulin可增強結直腸癌細胞HCT116的侵襲能力，并且其上清液可增加HUVEC細胞的侵襲能力，可能是通過增加MMP2、MMP7的表達來實現的。綜上所述，結直腸癌細胞過表達tricellulin可能通過調控MMP2、MMP7的表達促進HUVEC細胞的侵襲能力。本研究為探索tricellulin調控結直腸癌侵襲轉移提供了新的理論依據，但仍需更深入的探索。

4 結論

結直腸癌中過表達tricellulin可能通過MMP2、MMP7調控HUVEC細胞的侵襲能力，可能與腫瘤血管生成密切相關。Tricellulin有望成為結直腸癌治療的分子靶點。