飼用玉米連作土壤可培養細菌多樣性與肥效菌株監測

車 娟，江 旭，周義清，張 偉*，阮志勇，3，4*

（1.新疆師范大學生命科學學院，特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/中國農業科學院-國際熱帶農業中心可持續農業聯合實驗室，北京 100081；3.西藏農牧學院資源與環境學院，西藏 林芝 860000；4.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

玉米是甘肅省種植面積最廣泛的糧飼兼用作物。隨著草牧業的發展，玉米種植面積逐漸擴大，不利于輪作倒茬，致使土壤也缺少休養生息的機會。目前的種植模式以連作為主，長期連作會出現植株矮小、葉片褐色斑點、葉緣枯焦、植株發育緩慢、節間變短、葉片條紋狀失綠等癥狀［1］。盡管玉米是耐連作的作物，但長期連作對玉米的高產穩產仍然存在潛在風險［2］。集約化種植會引起農業化學污染、加速土地退化和高抗性害蟲的傳播等缺點［3］，亟待科學、高效、綠色的解決措施，為糧食生產、農業可持續發展提供堅實的保障。

生物多樣性的維持對生態系統的長期可持續發展至關重要，土壤微生物群落的組成和豐富程度在生態系統中起著關鍵作用，可以預測多種生態系統功能，例如植物多樣性和生產力、土壤碳同化和養分循環等［4］。土壤生物多樣性隨時間的推移保持更多和更少可變的生態系統功能，從而穩定多種生態系統功能，并在集約化管理土壤中，土壤生物多樣性正迅速下降，其中四分之一的土壤現已退化，導致生物生產力降低［5］。

利用植物促生菌（PGPB）作為生物制劑促進植物生長、改善植物健康和生產力，并緩解連作障礙等已有大量的報道［6-8］，PGPB在解決土壤因過量施用化肥所引起的生態環境污染問題具有重要作用［9］。PGPB對植物的促生作用通過多種機制以各種直接和間接的方式促進植物的生長發育。大量研究表明微生物能合成植物激素［10］，吲哚乙酸（IAA）是最重要的植物激素之一，可改善根部表面積，根、根毛和側根的形成和伸長，增加養分和水分的吸收，從而影響植物的整體生長發育［11］。土壤中的磷大多不能直接被植物吸收利用，能將土壤中難以吸收利用的磷轉化為植物可吸收利用的磷，溶磷細菌具有重要作用［12］。研究表明，甘肅水砂田玉米土壤有效磷含量自1983年以來呈逐漸升高的趨勢，但磷素仍中度短缺［13］，與全國相比，河西地區土壤磷素屬中等偏下水平［14］。氮素對生物生存十分重要，土壤中微生物的固氮作用是土壤氮素的主要來源之一，固氮微生物具有將氮氣轉化成氨的能力［15］。PGPB資源豐富，具有多功能促生的PGPB菌屬也已有大量報道［16］。萬兵兵等［17］在砂質潮土中分離的5株玉米PGPB中篩選出1株具固氮、解磷、解鉀及產IAA的Bacillus屬菌株。You等［18］從玉米根系篩選出1株具溶解無機磷和解鉀能力的Burkholderia cenocepaciaCR318，發現能顯著促進玉米植株和根系的生長。

從不同連作年限土壤中分離細菌已有大量研究，但全面地從玉米短期連作不同年限分離并篩選具促生肥效功能細菌的研究報道較少。本試驗在常規的連作耕作方式下，選取甘肅7年連作玉米，從土壤分別分離并篩選出具有產IAA、溶磷、固氮等促生功能的細菌，挖掘出更多的當地微生物資源，篩選出與當地玉米長期種植品種相匹配，競爭性強的高效促生菌，為后期開展促生菌株及促生組合菌株與玉米植株互作影響的研究以及為高效復合微生物接種菌劑的研發和應用奠定堅實的理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品

2019年12月采自甘肅省張掖市民樂縣六壩鎮玉米不同連作年限的土壤，連作年限分別為1、2、3、6、7年，分別編號為C1、C2、C3、C6、C7。

1.1.2 培養基與試劑

牛肉膏蛋白胨培養基（NA）［19］用于細菌的分離純化與保藏，PKO（Pikovaskaias）無機磷培養基［19］用于溶無機磷能力的測定，孟金娜有機磷培養基［19］用于溶有機磷能力的測定，阿須貝（Ashby）培養基［17］用于固氮菌的分離純化與保藏，無氮培養基［19］用于固氮菌的固氮酶活性的測定，具體配方見相應參考文獻。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米不同連作年限土壤樣品細菌的分離

使用NA固體培養基和Ashby固體培養基梯度稀釋法處理各連作年限土壤樣品［19］。置于30 ℃的恒溫培養箱培養3～5 d后，挑選顏色、形態不同的菌落進行連續劃線分離純化。

1.2.2 細菌16S rRNA

純化后菌株進行16S rRNA提取，PCR擴增產物送至北京博邁德基因技術有限公司進行測序，測序結果提交到http：//ezbiocloud.net/數據庫進行比對。用MEGA 7.0進行鄰近法聚類分析，并構建系統發育樹，Bootstrap值為1000。

1.2.3 產IAA能力的測定

從NA培養基分離純化得到的細菌參照Libbert等［20］的方法初步篩選產IAA菌株，測定單位體積發酵液中IAA的含量。

1.2.4 溶磷能力的測定

將從NA培養基分離純化的細菌接種于有機磷和無機磷培養基，于30 ℃中培養7 d，觀察有無溶磷圈的出現。對陽性菌株再次培養，根據菌株形成的溶磷圈直徑（D）/菌落直徑（d）確定各菌株溶解有機磷和無機磷能力的大小［21］。

1.2.5 固氮能力的篩選及固氮酶活性的測定

從Ashby培養基分離中純化的細菌用相同培養方法連續傳代3次篩選，將生長良好的菌株視為具有固氮能力的菌株。參照舒健虹等［22］的方法，采用青島科創質量檢測有限公司的固氮酶（NITS）酶聯免疫分析試劑盒測定。通過標準曲線計算樣品中NITS的活性，其中回歸方程為Y=100.723x-6.1694，R2=0.9994。

1.3 數據處理

采用Excel 2016和SPSS 26.0對數據進行統計和多樣性分析，用單因素方差分析和多重比較進行差異顯著性檢驗，方差齊性檢驗用Turkey檢驗法，P＜0.05代表有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 玉米連作7年土壤中細菌的分離與初步鑒定

圖1 各連作年限可培養細菌代表菌株16S rRNA基因序列基于鄰近法的系統進化發育樹

圖2 各連作年限可培養細菌屬分類信息

從所有樣品分離獲得了共224株細菌，不同種屬的細菌共200株，隸屬于56個屬（圖1、2）。其中NA培養基分離得到163株，從Ashby培養基分離得到37株。所篩菌屬中豐度最高的為Pseudomonas，占總菌株的18.50%。此外Bacillus菌屬18株、Arthrobacter菌屬15株、Microbacterium菌屬10株、Streptomyces菌屬10株。不同連作年限土壤樣品分離細菌中，C1有50株，屬于31個屬；C2有33株，屬于17個屬；C3有31株，屬于18個屬；C6有38株，屬于21個屬；C7有48株，屬于25個屬。各連作年限分離到細菌豐度最高的屬均為Pseudomonas，C1有6株細菌、C2有8株細菌、C3有5株細菌、C6有7株細菌、C7有11株細菌。此外，優勢菌屬還包含Bacillus、Microbacterium、Arthrobacter、Pseudarthrobacter、Paenarthrobacter、Streptomyces、Agrobacterium、Luteimonas、Ensifer、Pseudoxanthomonas、Agrococcus、Rhodococcus、Pararhizobium、Pseudoclavibacter、Lysobacter、Paeniglutamicibacter、Kocuria、Aeromicrobium、Brevundimonas、Paenibacillus、Staphylococcus、Dietzia、Neorhizobium、Cytobacillus、Tenotrophomonas、Brevibacterium、Azotobacter27個 屬。其中，Pseudomonas與上述前16個菌屬在至少3個年份都被分離到。

2.2 菌株產IAA功能評價

NA培養基分離出的173株菌中有34株細菌具有產IAA的能力，分布于15個菌屬，其中Pseudomonas為豐度最高的菌屬（15株）。各連作年限中C7（7個屬）產IAA菌株的豐富度及多樣性最高，其他依次為C2、C1、C6、C3。各菌株分泌IAA能力的試驗結果表明：供試菌株產IAA的能力有很大差異，分 泌 量 在（1.28±0.05）～（3.80±0.33） mg/L之間，菌株Glutamicibactersp.NC75分泌IAA的能力最強，分泌量為（3.80±0.33） mg/L，Brebacillussp.NC77分泌IAA的能力次之，為（3.68±0.41） mg/L（表1）。

表1 玉米各連作年限細菌產IAA的能力

2.3 不同連作年限細菌溶磷能力功能評價

溶解有機磷試驗結果表明：上述供試細菌共篩選出25株具溶解有機磷能力的菌株，分布于7個菌屬，Pseudomonas為豐度最高的菌屬（15株）。研究表明，菌株溶磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）范圍在1.00～2.00之間則表明該菌株溶磷能力中等，NC716、NC349、NC226、NC235、NC213、NC642、NC751、NC155共8株溶解有機磷的能力高于中等值，且均屬于Pseudomonas。各連作年限中溶解有機磷能力菌株的豐富度及多樣性為C7＞C2＞C6＞C1＞C3。溶解有機磷能力試驗結果表明，供試菌株溶解有機磷的能力有明顯差異，溶磷率在（1.07±0.03）～（3.14±0.15）之間，菌株Pseudomonassp.NC716溶解有機磷能力最強，為（3.14±0.15），Pseudomonassp.NC349溶解有機磷能力次之，為（3.00±0.37）（表2），其溶解有機磷的效果見圖3a。

表2 玉米各連作年限細菌溶解有機磷和無機磷的能力

溶解無機磷的試驗結果表明：上述供試細菌共篩選出19株具有溶解無機磷能力的菌株，分布于8個菌屬，Pseudomonas為豐度最高的菌屬（12株）。溶解無機磷能力菌株的豐富度及多樣性為C6＞C7＞C2＞C1＞C3。菌株溶解無機磷能力試驗表明，供試菌株溶解無機磷的能力有較大差異，溶磷率在（1.03±0.4）～（2.00±0.17）之間，其中菌株Pseudomonassp.NC213溶解無機磷能力最強，為（2.00±0.17），Pseudomonassp.NC645溶解無機磷 能 力 次 之，為（1.77±0.46）（表2）。NC213、NC28溶無機磷效果見圖3b。綜上結果可知，菌株Pseudomonassp.NC213、Pseudomonassp.NC226、Pseudomonassp.NC645、Microbacterium sp.NC76和Pseudomonassp.NC716共5株菌均有產IAA、溶解有機磷和無機磷的能力。

2.4 不同連作年限細菌固氮能力的情況

Ashby培養基分離出51株固氮菌，經16S rRNA鑒定，各連作年限不同菌屬有37株，分布于17個屬。經無氮液體培養基篩選出26株優勢固氮菌。以本實驗室分離的1株具固氮能力的Bacillussp.LB6-1為陽性對照，對優勢固氮菌測定固氮酶活性表明，Ensifer（4株）和Pseudomonas（3株）為豐度最高的菌屬。各連作年限中固氮菌株的豐富度及多樣性為C6＞C2＞C7＞C1＞C3。菌株固氮能力試驗結果表明：供試菌株固氮能力有很大差異，固氮酶活性在（22.52±0.53）～（38.96±0.64） U/g之間。菌株Azotobactersp.AC21固氮酶活性最高，為（38.96±0.64） U/g，Agrobacteriumsp.AC13固氮酶活性次之，為（38.53±0.28） U/g（表3）。AC220、AC21固氮效果見圖3c。

表3 玉米各連作年限細菌固氮的能力

圖3 部分菌株溶解有機磷、溶解無機磷和固氮能力效果

2.5 可培養細菌與促生功能菌株分析

綜上所述，可培養細菌的分離在種植第1年較高，隨連作年限的增加，其多樣性與豐富度在第2年下降后一直呈上升的趨勢；促生功能篩選試驗共對224株供試菌測定產IAA、溶無機磷、溶有機磷、固氮的能力，共篩選出81株具有上述功能的細菌，其中55株具產IAA、溶無機磷和有機磷的功能，26株為優勢固氮菌。具促生功能細菌的豐富度及多樣性隨連作年限的增加呈上升的趨勢，具體表現為先增加，于第3年下降再增加（圖4）。

圖4 各連作年限分離細菌與篩選促生功能細菌數量

3 討論與結論

微生物的多樣性與土壤健康及作物產量等息息相關，高微生物多樣性和生態系統多功能性存在顯著的正相關關系［23］。研究表明，微生物多樣性降低是玉米長期連作（幾十年）最顯著的表現之一，土壤生物多樣性喪失和土壤群落組成單一化會損害和抑制植物多樣性、養分保持和養分吸收等多種生態系統功能［4-5］。本試驗從玉米7年連作土壤中共分離出隸屬于56個屬的細菌224株。不同連作年限分離細菌的豐富度及多樣性為C1＞C7＞C6＞C3＞C2，篩選肥效功能細菌為C7＞C6＞C2＞C1＞C3，二者的豐富度及多樣性相協同變化，均在C3降低后隨連作年限的延長呈上升趨勢，表明7年連作可明顯影響玉米土壤細菌群落，但產生的連作障礙問題有待進一步研究。也有研究長期連作會使土壤由細菌型轉為真菌型，僅通過可培養分離細菌的方法并不能表明7年內連作玉米不產生連作障礙，應結合土壤中真菌的豐度和產量等因素辯證說明。本試驗各連作年限及肥效功能細菌的優勢菌屬均為Pseudomonas，其豐富度及多樣性也隨連作年限的增加而上升，分析認為這與Pseudomonas在土壤中的重要地位及施肥方式等息息相關［24-25］。此外，以Pseudomonas為首的17個優勢菌屬在至少3個年份中都存在，推測7年連作對此類菌屬的影響較小，是土壤中可穩定存在的類群。細菌及肥效細菌的多樣性和豐富度隨連作年限的變化，推測是由于荒土環境中，隨玉米生長與連作等耕作措施下，打破了荒土原有穩定的微生物群落結構，通過植物-土壤-微生物不間斷的相互作用，以Pseudomonas為主的微生物類群重建，適于玉米生長的微生物群落結構的過程。這可能與玉米是耐連作作物密切相關，由此推測也可能是玉米初期連作對土壤的影響相對耐連作作物較低的原因之一。本試驗中分離得到的Bergeyella、Moheibacter、Cytobacillus、Lacisediminihabitans、Neobacillus、Serinibacter等屬較少被報道，增加了土壤可培養細菌的范疇。

絕大多數已被報道的高產IAA、溶磷菌株主要屬于Pseudomonas、Bacillus、Azotobacter、Bradyrhizobium、Burkholderia、Rhizobium、Azospirrulam和Rhizobia等［26-27］。許多能夠通過共生或非共生固氮的菌株，大部分屬于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Firmicutes和Cyanobacteria［28］。本 試 驗 分 別 篩 選 出 具 有產IAA、溶解有機磷、溶解無機磷和固氮能力的菌株各34、25、19和26株，具有以上各肥效功能細菌的豐富度及多樣性隨連作年限的增加均呈上升的趨勢，與耐連作藥用植物懷牛膝的結果一致［29］；并且優勢菌屬均為Pseudomonas，與Tilak等［30］結果一致，其作為目前促生菌中研究較多的細菌，是重要的菌種資源；此外，Ensifer在固氮功能的篩選豐度與Pseudomonas并列。本實驗中不同肥效功能菌株的能力及多樣性也具有差異：產IAA能力較高的菌屬依次是Glutamicibacter、Brevibacillus、Ensifer、Pseudomonas等，研 究 發 現Glutamicibacter可促進平菇生長并提高其產量［31］，有耐鹽的能力［32］。因此，本試驗Glutamicibactersp.NC75菌株可能有耐鹽潛力；溶解有機磷能力高于中等值的8株菌中豐度最高的為Pseudomonas，并且其與Microbacterium、Pseudarthrobacter、Dietzia等4個屬均有溶解有機磷和無機磷的能力；固氮酶活性中較高的依次 是Azotobacter、Agrobacterium、Pseudomonas、Ensifer、Lysobacter5個屬，研究發現在谷物、豆類等經濟作物生長發育中根系會積極招募固氮微生物［33-34］，van Deynze等［35］發現玉米氣生根分泌物可高效固氮。此外，Pusillimonas具有產IAA的能力及Dietzia和Moheibacter在溶磷功能上研究較少，擴充了土壤可培養細菌肥效功能的資源。本試驗與舒建虹等［22］均用NITS酶聯免疫分析試劑盒測定菌株的固氮酶活性，也有研究表明能否高產胞外多糖也是固氮菌篩選的一項指標［36］，只檢測菌株并不足以表明菌株的固氮能力。因此，僅通過上述測定方法判斷固氮酶活性并不嚴謹，但本試驗篩選的固氮菌仍有固氮能力的潛力，需要進一步進行試驗驗證。

微生物促進植物生長的機制有多種，而且可兼具多種促生機制［6］。本試驗篩選出5株可同時產IAA、溶解有機磷和無機磷功能的細菌。各連作年限中，具多功能肥效細菌的豐富度及多樣性與連作年限的增加呈正比。經鑒定具有2種以上功能的19株菌，隸屬于5個屬，其中Pseudomonas為優勢菌屬。張廣志等［37］從多年栽培菜地土壤分離篩選出20株兼具解磷和反硝化活性的細菌，其中高效解磷細菌中具顯著反硝化活性的有10株均屬于Pseudomonas。因此，本試驗篩選出的5株多功能細菌可為微生物肥料生產菌株的潛在多功能菌種，是否具有生防功能也值得深入研究，相比外源微生物，其在甘肅玉米農業實踐中作為生物修復劑或生物防治劑更有競爭力，可在后期進行盆栽及大田試驗并追蹤監測。