基于二次通用旋轉組合設計的暗紫貝母優質高產施肥研究

鄧秋林，楊正明，陳 雨，文秋姝，張亞琴，李思佳，劉震東，陳興福*

（1.四川農業大學，四川 成都 611130；2.西南民族大學，四川 成都 610041；3.青白江區農業農村局，四川 成都 610300；4.四川松贊雪貝生物科技有限公司，四川 松潘 623301）

百合科貝母屬植物暗紫貝母Fritillaria unibracteataHsiao et K.C.Hsia是藥材川貝母的基原植物之一，最初收載于1963版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》），以干燥鱗莖入藥。其具有清熱潤肺、化痰止咳、散結消癰的功效；用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、痰中帶血、瘰疬、乳癰以及肺癰等癥［1］。暗紫貝母主要分布于四川省若爾蓋高原和川西高山峽谷東段，包括四川阿壩州各縣以及青海久治、斑瑪等地，生長于海拔3200～4500 m的草甸和灌叢中［2］。暗紫貝母在中藥材市場上的需求量大，但其鱗莖生長速度特別慢，從種子長成商品藥材一般需要4年的時間［3］。隨著藥材用量的不斷增加，野生資源已基本枯竭，藥用暗紫貝母長期存在著供不應求的問題。只有加強暗紫貝母的栽培技術研究，才能有效滿足川貝母的市場供應。目前，暗紫貝母的種植僅限于試驗階段，尚未大面積栽培。施肥是中藥材種植的關鍵環節之一，科學合理施肥可以有效地提高中藥材的產量和質量［4-5］。曹超仁等［6］發現，氮、磷、鉀配施對棗果單果重和灰分有顯著影響；夏貴惠［7］發現，丹參的丹酚酸類成分與丹參酮類成分積累所需的氮、磷、鉀配比不同；盧挺等［8］發現氮、磷、鉀的合理配施能夠促進廣金錢草的生長并提高產量，同時影響夏佛塔苷的積累。對暗紫貝母的研究現主要集中在成分［9-12］、藥理作用［13-14］、組織培養［15-17］等方面，對大田栽培［18］尤其是施肥的研究較少。

本研究通過對暗紫貝母進行不同水平的氮、磷、鉀配施處理，按照《中國藥典》（2015版，第一部）川貝母項下標準，對不同施肥水平下培育的暗紫貝母質量進行研究，同時研究其對產量的影響，以期為暗紫貝母的高產優質栽培提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2016年8月至2017年10月在四川省松潘縣水晶鄉四川松贊雪貝生物科技有限公司川貝母標準化生產基地（103°42′E，32°57′N）進行，該地區年平均溫度6℃，年平均降水量730 mm，無霜期80 d。試驗地土壤pH 5.74，有機質161.00 g/kg，堿解氮914.66 mg/kg，有效磷14.58 mg/kg，速效鉀88.89 mg/kg。

1.2 試驗材料

供試材料為4年生暗紫貝母，由四川省松潘縣水晶鄉四川松贊雪貝生物科技有限公司川貝母標準化生產基地提供，經四川農業大學陳興福教授鑒定為百合科貝母屬植物暗紫貝母（F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia）。

1.3 試驗設計

試驗研究采用三因素五水平二次回歸通用旋轉組合設計，設置氮肥（尿素，N 46%）、磷肥（過磷酸鈣，P2O512%）、鉀肥（硫酸鉀，K2O 45%）3個因素，5個水平，共20個小區，各因素編碼水平見表1，實施方案見表2。暗紫貝母于2016年8月栽種，小區面積3 m×1 m=3 m2，株距10 cm，行距15 cm，每個小區栽種貝母鱗莖180粒，貝母鱗莖大小為12 mm。在栽培前施用15000 kg/hm2的農家肥作為底肥。后期除肥料施用外，其他處理與基地管理一致。氮肥、磷肥和鉀肥均作追肥施用，分別在暗紫貝母齊苗期、開花期和掛果期施用，用量分別為總量的20%、35%和45%。

表1 因素水平編碼表 （kg/hm2）

表2 試驗設計與實施方案

1.4 測定項目及方法

1.4.1 暗紫貝母產量的測定

于2017年8月6日，在暗紫貝母植株地上部分完全倒苗后進行采挖，分別按照試驗小區編號測定產量，并折算成每公頃的產量。

1.4.2 暗紫貝母總灰分的測定

總灰分的測定參照《中國藥典》（2015版，第四部）［19］通則2302項下的相關方法進行測定。

1.4.3 暗紫貝母浸出物的測定

浸出物的測定參照《中國藥典》（2015版，第四部）［19］通則2201項下的熱侵法進行測定，使用50%乙醇進行浸提。

1.4.4 暗紫貝母總生物堿的測定

總生物堿的測定參照《中國藥典》（2015版，第一部）［1］川貝母項下的總生物堿含量的提取和測定方法進行測定。

對照品溶液的制備：精密稱取西貝母堿對照品1.8 mg，用三氯甲烷溶解定容至25 mL，即得質量濃度0.072 mg/mL的標準品溶液。

標準曲線的繪制：精密量取對照品溶液0、0.3、0.6、1.2、1.8、3.0 mL，置于25 mL具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL、再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液（取溴甲酚綠0.05 g，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液6 mL使其溶解，再加入磷酸二氫鉀1 g，加水使其溶解并稀釋至l00 mL，即得）2 mL，密塞，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續濾液，以相應的試劑為空白，用酶標儀在415 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

含量測定：精密稱本品粉末1.000 g，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液1.5 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液20 mL，置80℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過，濾液置25 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（V∶V=4∶1）混合溶液至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使其溶解，按照標準曲線的制備項下的方法，自“精密加水5 mL”起，依此方法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中西貝母堿的重量（mg），計算，即得。

1.5 數據分析

根據所測得的數據，使用Excel 2010進行數據的換算和處理，利用DPS 7.05數據處理系統對數據進行回歸模型的建立和分析，最終用Excel 2010制圖和分析。

2 結果與分析

2.1 模型的建立與檢驗

使用DPS 7.05對試驗結果進行回歸分析，分別得到產量（Y1）、總灰分（Y2）、浸出物（Y3）、總生物堿（Y4）與N（X1）、P2O5（X2）、K2O（X3）的回歸模型。用F檢驗法分別檢驗方程各項回歸系數、方程總回歸系數和失擬度，得到方差分析表（表3）。

表3 方差分析結果

由表3可知，方程Y1、Y2、Y3、Y4的FLf均不顯著，說明模型能真實反映暗紫貝母產量、總灰分含量、浸出物含量、總生物堿含量與氮、磷、鉀肥之間的相互關系；方程Y1、Y2、Y3、Y4的FR均達到了0.05顯著水平，說明方程Y1、Y2、Y3、Y4的模型成立，方程與實際情況擬合程度較好。為了提高回歸方程的穩定性，增強預測效果，對其各回歸系數進行顯著性檢驗，剔除0.10顯著水平下不顯著的項后，得到優化的回歸方程Y1′、Y2′、Y3′和Y4′。

2.2 模型分析

2.2.1 主效應分析

利用表3中各項回歸系數的F值計算各因素對因變量的貢獻率，由此可知各因素對產量、總灰分含量、浸出物含量、總生物堿含量影響的大小。使用貢獻率計算公式計算，分別得到各因素對暗紫貝母產量和質量的貢獻率（表4）。

表4 單因素貢獻率

由表4可知，各因素對暗紫貝母的產量、總灰分、浸出物、總生物堿的影響不同。各因素對產量和總灰分的影響大小為K2O＞N＞P2O5，對浸出物和總生物堿的影響大小為N＞P2O5＞K2O。結果表明K2O對產量和總灰分的影響最大，P2O5對產量和總灰分的影響最小，N處于中間調控的地位；N對浸出物和總生物堿的影響較大，其次是P2O5，K2O對浸出物和總生物堿的影響最小。

2.2.2 單因素效應分析

由表3可知，N、P2O5、K2O對總灰分有顯著影響，N對總生物堿有顯著影響。由此分別計算出N、P2O5、K2O對總灰分、總生物堿的單因素效應方程，再由方程可得單因素圖（圖1）。

圖1 單因素效應分析

由圖1A可知，隨著N用量的增加，總灰分呈逐漸降低的趨勢；隨著P2O5用量的增加，總灰分呈逐漸升高的趨勢；隨著K2O用量的增加，總灰分呈先升高后降低的趨勢，在-1.682水平含量最低。由圖1B可知，隨著N用量的增加，總生物堿含量呈先降低后升高的趨勢，在1.682水平，總生物堿含量最高。說明高水平的N有利于暗紫貝母總灰分的降低，P2O5、K2O的施用會升高總灰分，高水平的N有利于總生物堿含量的升高。

2.2.3 互作效應分析

由表3可知，P2O5、K2O互作對產量有顯著影響，N、P2O5互作對浸出物有較顯著的影響。使用降維法固定單因子為零，可得到P2O5-K2O互作對產量和N-P2O5互作對浸出物的效應方程，再分別作互作的效應圖（圖2）。

圖2 互作效應

由圖2可知，在K2O處于較高水平時，隨著P2O5的增加，產量越來越高；在P2O5處于較高水平時，隨著N的增加，浸出物含量越來越高。說明P2O5-K2O互作對產量有協同效應，N-P2O5互作對浸出物含量有協同效應。低P2O5低K2O或高P2O5高K2O均有利于暗紫貝母產量的形成，為理想的互作區間，同理，低N低P2O5或高N高P2O5均有利于增加暗紫貝母的浸出物含量。

2.3 暗紫貝母高產優質方案分析

考慮到實際生產時存在土壤、氣候環境差異的影響，通過使用統計頻數法進行分析可以得到一個合適的高產范圍以及高總生物堿含量范圍的最優配施方案，其中總生物堿為暗紫貝母的指標性成分，因此設置產量≥459.18 kg/hm2為高產，總生物堿含量≥0.07%為優質。

由表5、6可知，當施用N 138.33～190.77 kg/hm2、P2O5541.75～720.25 kg/hm2、K2O 337.49～454.52 kg/hm2時，產量可達459.18 kg/hm2；施用N 163.82～217.14 kg/hm2、P2O5524.13～737.88 kg/hm2、K2O 335.84～456.16 kg/hm2時，總生物堿含量可達0.07%及以上。因此，當施用N 163.82～190.77 kg/hm2，P2O5541.75～720.25 kg/hm2，K2O 337.49～454.52 kg/hm2時，產量可達459.18 kg/hm2，總生物堿含量可達0.07%及以上。

表5 產量≥459.18 kg/hm2的頻率分布及農藝措施

表6 總生物堿含量≥0.07%的方案頻數分布

2.4 基于灰色關聯度和DTOPSIS法綜合評價暗紫貝母產量和質量

為了利用暗紫貝母的各項指標對暗紫貝母整體做出一個客觀評價，本研究綜合了產量、總灰分、浸出物、總生物堿，使用灰色關聯度法計算出各參評材料的權重值和灰關聯度ri，并進行排序，使用灰關聯權重值進行了DTOPSIS法處理，得到DTOPSIS法的相對接近度值Ci及其排序（表7）。總灰分是中藥材經加熱熾灼灰化遺留下的無機物，灰分含量過高可能含有其他無機物，因此總灰分越低越好。

由表7可知，采用灰色關聯度法和DTOPSIS法的綜合評價結果一致。2種方法所得綜合表現最優的是處理10，即當N 329 kg/hm2、P2O5631 kg/hm2、K2O 396 kg/hm2時暗紫貝母的產量和質量綜合最優。由表7可知灰色關聯度法所得關聯度最大差異為19.75%，DTOPSIS法所得Ci值最大差異可達66.05%，DTOPSIS法能夠更好地區分材料的優劣。

表7 待評價材料的加權關聯度ri與Ci排序值比較

3 結論與討論

本試驗應用二次通用旋轉組合設計，建立了暗紫貝母產量與質量指標的數學模型，通過對模型的分析，K2O對產量和總灰分的影響最大，N對浸出物和總生物堿的影響最大；通過暗紫貝母高產優質方案分析、灰色關聯度和DTOPSIS法綜合評價暗紫貝母產量和質量，同時結合實際應用價值，本試驗得到的暗紫貝母高產優質的施肥方案為N 163.82～190.77 kg/hm2、P2O5541.75～720.25 kg/hm2、K2O 337.49～454.52 kg/hm2。

合理施肥能夠有效提高藥用植物的產量和促進藥用植物有效成分的累積［20］。大量研究表明對根類藥材產量影響較大的是氮肥［21-23］，在本研究中，鉀肥對暗紫貝母的產量影響最大，一方面可能是因為土壤的速效氮含量高，再施加氮肥作用不大，同時氮肥的過量施用會使地上部分徒長，地下部分產量減低；另一方面鉀肥的施用能促進麥冬的干物質積累，并有利于碳水化合物向根部運輸和積累，促進植株對氮、鉀的吸收［20］。李瓊芳等［24］的研究結果也表明氮、磷、鉀肥對川麥冬產量的影響大小為鉀肥＞氮肥＞磷肥。低磷低鉀或高磷高鉀均有利于暗紫貝母產量的形成，在張浩等［25］的研究中，高產處理黃連養分含量根莖以低氮低鉀（磷）為主。氮、磷、鉀肥配施會影響藥材中灰分、浸出物以及有效成分的含量［26-28］。在氮肥和鉀肥用量一定時，隨著磷肥用量的增加，棗果的灰分增加；在氮肥和磷肥用量一定時，隨著鉀肥用量的增加，棗果的灰分先升高后降低［4］。氮肥的施用可以降低暗紫貝母總灰分含量，鉀肥對總灰分含量的影響最大。在本研究中隨著氮肥用量的增加，總生物堿含量呈先降低后升高的趨勢，氮肥對生物堿的影響最大，其次為磷，然后是鉀，這與張燕等［29］得到的各元素對水蘇堿的影響大小相同。氮是生物堿的有機組成部分之一，因此其對生物堿的合成影響較大。