叢枝菌根真菌對鎘脅迫下黑麥草光合生理的響應(yīng)

韓 瑋

（廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 廣安 638000）

大氣顆粒物沉降、有毒有害污染物的亂排亂放、化工產(chǎn)業(yè)污水灌溉、農(nóng)用化學(xué)殺蟲除草劑的違法使用等問題導(dǎo)致土壤重金屬污染現(xiàn)象愈加突出，對農(nóng)作物質(zhì)量、動物和人體健康以及城市生態(tài)環(huán)境造成危害［1-2］。其中重金屬鎘（Cd）因其具有危害性大、易富集、難降解等特性，被人們廣泛關(guān)注［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，Cd污染不僅會引起土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分保持功能的下降失調(diào)，還會較大程度地影響植物光合作用、氣體交換、養(yǎng)分吸收等生理活動，導(dǎo)致植物生長受阻，干物質(zhì)積累能力下降，新陳代謝活動受到顯著抑制［5-7］。有試驗表明Cd脅迫下匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）初期生長受到抑制，葉綠素含量下降，丙二醛（MDA）含量不斷上升，抑制作用隨Cd濃度的增加而增強；Cd濃度為200 mg·L-1條件下，葉綠素和MDA含量分別是對照的37%和864%；植株葉片中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性隨Cd濃度增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢［8］。唐星林等［9］發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵（Solanum nigrum）葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）以及PS II最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）均不同程度小于對照處理，單株、地上部和根系生物量與對照相比分別減小了47%、33%和49%，證實Cd脅迫處理下因非氣孔因素限制了龍葵光合作用。基于上述研究，增強植物對重金屬的抗性、修復(fù)城市土壤系統(tǒng)，是目前亟須解決的問題。

生物修復(fù)技術(shù)在修復(fù)重金屬污染土壤中的潛在作用是近年來研究的熱點問題。其中叢枝菌根（AM）真菌是一種土壤有益微生物，能夠與大多數(shù)高等植物建立互惠共生關(guān)系，廣泛存在于各種重金屬污染的土壤中［10-11］。AM真菌有助于寄主植物從土壤中獲取養(yǎng)分和礦質(zhì)元素，緩解土壤中存在的各種非生物（鹽害、高溫、干旱等）脅迫，分解有毒物質(zhì)、修復(fù)重金屬污染土壤等［12］。研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌（Glomus intraradice）BEG141能提高Cd污染處理下玉米（Zea mays）的株高、生物量、光合色素含量、光合特性和抗氧化酶活性，降低Ci和葉片MDA含量，減輕Cd脅迫的效應(yīng)并促進植物生長［13］。溫室盆栽試驗下，添加Cd的處理對菌根侵染率無影響且顯著改善花生（Arachis hypogaea）生長發(fā)育狀況，顯著提高植株體內(nèi)磷含量與吸收速率；與不接種對照（NM）相比，葉片葉綠素相對含量增加12%；同一污染水平下，接種處理植株的Fv/Fm和PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）均顯著高于NM處理，Pn、蒸騰速率（Tr）和Gs均顯著增大，而Ci顯著降低，證實了AM真菌可通過提高花生對磷的吸收來增加光合作用，增強抗Cd毒害的能力，以促進植株生長［14］。賴娟等［15］也發(fā)現(xiàn)Cd污染條件下美洲黑楊（Populus deltoides）接種根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）后脯氨酸含量顯著增加，滲透調(diào)節(jié)能力進一步加強，并恢復(fù)固碳能力和激素平衡。

黑麥草（Lolium perenne）屬于禾本科黑麥草屬植物，在我國栽培范圍較廣且經(jīng)濟效益強，品種近20種。因其生長迅速、分蘗能力強、易成坪、莖葉柔嫩光滑、耐踩踏、品質(zhì)好，被廣泛用于我國南北方的牧草和城市草坪草。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌在一定程度上能夠緩解Cd污染對黑麥草株高、根長和生物量積累的抑制作用，顯著提高葉片葉綠素含量［16］。但重金屬Cd脅迫下菌根真菌對黑麥草光合生理、Cd吸收以及生態(tài)耐受性等方面的影響則少見報道。因此，本研究以黑麥草為對象，探究Cd污染條件下接種不同AM真菌對植株光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒?、生理活性、養(yǎng)分吸收、生長變化以及Cd的吸附作用，從而認(rèn)識AM真菌對重金屬脅迫的緩解效應(yīng)，為今后修復(fù)重金屬Cd污染的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為多年生黑麥草，供試AM真菌菌種為摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，F(xiàn)M）、變形球囊霉（Glomus versiforme，GV）。AM真菌的接種物來源于中國AM真菌種質(zhì)資源庫，接種物為孢子、侵染根段、外生菌絲和培養(yǎng)基質(zhì)的混合物。供試土壤為壤土，經(jīng)高壓滅菌（溫度121 ℃，壓力0.12 MPa）后備用。將黑麥草種子用4%NaClO溶液消毒，然后再用無菌水反復(fù)沖洗晾干，在光照培養(yǎng)箱中催芽，選擇大小一致、飽滿成熟的黑麥草種子進行播種。試驗容器采用聚乙烯盆缽，規(guī)格為25 cm×20 cm，每盆裝3 kg土壤，試驗土壤均風(fēng)干后過1 mm篩。土壤pH 6.94，電導(dǎo)率130 μS·cm-1，有效磷56.3 mg·kg-1，堿解氮79.5 mg·kg-1，有機質(zhì)2.1%。

1.2 試驗方法

采用室內(nèi)盆栽試驗，分別設(shè)Cd污染濃度為0、5、15、30 mg·kg-1，接種AM真菌FM、GV、混合處理（FM+GV）以及不接種處理（NM），共16個處理，隨機排列，每個處理3次重復(fù)。具體操作為稱取滅菌土壤并測量含水率，根據(jù)換算公式得到土壤干重，以確定添加Cd的量。不同濃度Cd處理以CdCl2溶液的形式添加到土壤中，得到0、5、15、30 mg·kg-1Cd濃度水平污染土，分別記為Cd0、Cd5、Cd15和Cd30。對 于FM、GV以 及FM+GV處理組，每盆土接種AM真菌菌劑30 g（50個孢子/g），并混至均勻；對照NM處理組，則接種滅菌的菌劑30 g，以保持相同的微生物環(huán)境。每盆播種50粒黑麥草種子，土壤水分保持在田間持水量的60%～70%，植物生長期間保持正常水分供應(yīng)。試驗在自然光照保溫室中進行，晝、夜間溫度和濕度分別為29、20 ℃和60%、75%。黑麥草培養(yǎng)65 d后開始測量各項指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定

生長指標(biāo)測定：地表到植株最高點作為株高。植物在烘箱中殺青10 min后烘至恒重并稱重。

菌根侵染率的測定：采集黑麥草根系，用乳酸甘油染色法進行計算菌根侵染率［17］。公式如下：菌根侵染率=Σ（0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+ 20%×根段數(shù)+…+100%×根段數(shù)）/總根段數(shù)。

光合指標(biāo)的測定：Pn、Tr、Gs、Ci參數(shù)采用CIRAS-2便攜式光合測定系統(tǒng)（美國）測定。

生理指標(biāo)的測定：SOD活性采用鄰苯三酚自氧化法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。

葉綠素和N含量的測定：采用手持式葉綠素測定儀（TYS-B）測定葉綠素含量；植物體N含量采用硫酸-過氧化氫消煮、堿化后蒸餾定氮的方法測定。

葉綠素?zé)晒獾臏y定：采用FMS-2熒光儀進行測定。測量前進行暗適應(yīng)，并用錫箔紙包裹待測葉片。得到暗適應(yīng)參數(shù)后，計算得出Fv/Fo值、Fv/Fm值。

重金屬Cd含量的測定：采用原子吸收-石墨爐法測定植物地上部和根系的Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用DPS 7.5和SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、雙因素方差分析以及差異顯著性檢驗（LSD法，α=0.05）。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下AM真菌對黑麥草生長和菌根侵染率的影響

同一Cd濃度下，接種FM、GV以及FM+ GV處理均顯著增加了黑麥草株高和生物量。隨Cd濃度的增加，黑麥草的株高和生物量顯著下降。Cd濃度為30 mg·kg-1時，與NM相比，F(xiàn)M處理的黑麥草株高和地上干重分別提高14.6%和6.6%，GV處理下分別提高8.8%和6.9%，F(xiàn)M+GV處理下分別提高34.1%和18.8%。不同Cd濃度下，接種AM真菌各處理均對黑麥草根系存在侵染情況。隨Cd濃度的增加，AM真菌侵染率呈現(xiàn)下降的趨勢。Cd濃度為0 mg·kg-1時，接種FM+GV處理的黑麥草根系侵染率最高，為62.7%；Cd濃度為30 mg·kg-1時，F(xiàn)M處理侵染率下降為38.3%，GV處理為33.0%，F(xiàn)M+GV處理為42.7%（表1）。說明Cd處理下AM真菌與黑麥草建立了良好的共生關(guān)系，F(xiàn)M+GV處理侵染效果更好（圖1）?？芍?，在不同Cd濃度處理下，接種AM真菌處理均可增加黑麥草的株高和生物量，其中FM+GV處理接種效果優(yōu)于FM、GV處理。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理及其交互作用對黑麥草株高和干重有顯著影響，其中Cd濃度對黑麥草株高的影響較大（表2）。

2.2 Cd脅迫下AM真菌對黑麥草葉綠素和N含量的影響

同 一Cd濃 度 下，F(xiàn)M、GV以 及FM+ GV處理均顯著增加了黑麥草葉片葉綠素和N元素的含量，不同接種間表現(xiàn)為FM+GV＞FM＞GV＞NM，且差異顯著（P＜0.05）。同一接種處理下，隨Cd濃度的增加，葉綠素含量和地上部N含量、根系N含量呈現(xiàn)下降的趨勢。Cd濃度為30 mg·kg-1時，與NM相比，F(xiàn)M處理的黑麥草葉綠素含量、地上部N含量和根系N含量分別提高8.4%、45.6%和41.2%，GV處理下分別提高6.5%、32.4%和29.4%，F(xiàn)M+GV處 理 分 別 提 高26.2%、70.6%和85.3%（表3）。由此可知，F(xiàn)M+GV處理對葉綠素含量、植物地上部和根系N含量的增加優(yōu)于FM、GV處理，表明接種AM真菌均能不同程度促進Cd脅迫下黑麥草葉綠素的合成，提高植株對N元素的吸收。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理及其交互作用對黑麥草葉綠素含量和地上部、根系N含量有顯著影響，其中Cd濃度對根系N含量的影響較大（表2）。

表1 Cd處理下黑麥草生長情況和AM真菌侵染狀況

圖1 叢枝菌根真菌侵染黑麥草情況

表2 Cd脅迫下黑麥草各指標(biāo)雙因素方差分析

表3 Cd處理下黑麥草葉綠素和N含量

2.3 Cd脅迫下AM真菌對黑麥草葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

同一Cd濃度下，F(xiàn)M、GV以及FM+ GV處理均增加了黑麥草葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）。隨Cd處理濃度的增加（0～30 mg·kg-1），F(xiàn)v/Fm值和Fv/Fo值呈現(xiàn)下降的趨勢。Cd濃度為30 mg·kg-1時，與NM相比，F(xiàn)M處理的黑麥草Fv/Fm值和Fv/Fo值分別提高5.4%和11.5%，GV處理分別提高1.4%和10.5%，F(xiàn)M+GV處理分別提高4.9%和19.7%（圖2）。由上述結(jié)果可知，在不同Cd濃度下，接種AM真菌各處理均能不同程度提高Fv/Fo值，對Fv/Fm值的提升效果較小。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理對黑麥草Fv/Fm值、Fv/Fo值有顯著影響，其交互作用對Fv/Fm值有顯著影響、對Fv/Fo值影響不顯著（表2）。

圖2 Cd脅迫下黑麥草PSⅡ最大光化學(xué)效率和潛在活性

2.4 Cd脅迫下AM真菌對黑麥草光合參數(shù)的影響

同一Cd濃度下，F(xiàn)M、GV以及FM+GV處理均增加了黑麥草葉片Pn、Tr和Gs，而降低了Ci。同一接種處理下，隨Cd濃度的增加，Pn、Tr和Gs均呈現(xiàn)下降的趨勢，而Ci則上升。在Cd濃度30 mg·kg-1下，與NM相比，F(xiàn)M處理的黑麥草葉片Pn、Tr和Gs分別增加15.6%、11.7%和7.5%，Ci下降5.2%；GV處理的黑麥草葉片Tr和Gs有所下降，Pn增加12.5%，Ci下降3.9%；FM+GV處理的黑麥草葉片Pn、Tr和Gs分別增加19.8%、28.3%和14.7%，Ci下降6.5%（圖3）。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理對黑麥草Tr、Pn、Gs、Ci影響顯著，其交互作用對Tr影響顯著、對Pn、Gs和Ci影響不顯著（表2）。

2.5 Cd脅迫下AM真菌對黑麥草生理變化的影響

同一Cd濃度下，F(xiàn)M、GV以及FM+ GV處理顯著增加了黑麥草葉片SOD、POD活性和可溶性蛋白含量，而降低了MDA含量。同一接種處理下，隨Cd濃度的增加，SOD活性和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)下降的趨勢，而POD活性和MDA含量則上升。在Cd濃度為30 mg·kg-1時，與NM相比，F(xiàn)M處理的黑麥草葉片SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分別增加19.6%、36.5%和17.7%，MDA含量下降41.4%；GV處理的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分別增加16.3%、32.0%和33.9%，MDA含量下降28.7%；FM+GV處理的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量分別增加29.3%、50.2%和82.3%，MDA含量下降50.0%（表4）。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理及其交互作用對黑麥草SOD、POD活性和可溶性蛋白、MDA含量影響顯著，其中Cd濃度對可溶性蛋白含量影響較大（表2）。

2.6 AM真菌對黑麥草Cd吸收的影響

同一Cd濃度下，F(xiàn)M、GV以及FM+ GV處理顯著增加了黑麥草根系對Cd的吸收，減少Cd向地上部的運輸。根系Cd含量為FM+GV＞FM＞GV＞NM。隨Cd濃度的增加，黑麥草地上部和根系Cd含量均顯著升高，其中，黑麥草根系Cd含量顯著高于地上部。在Cd濃度為30 mg·kg-1時，F(xiàn)M+GV處理的根系Cd含量最高，達606.7 mg·kg-1，地上部Cd含量也較高，達到88.1 mg·kg-1（表5）。雙因素方差分析表明，Cd脅迫、不同接種處理及其交互作用對黑麥草地上部與根系Cd含量的影響顯著，其中對根系Cd含量影響較大（表2）。

表4 不同處理下黑麥草生理變化

表5 不同處理下黑麥草地上部分和根系Cd含量 （mg·kg-1）

3 討論

3.1 AM真菌處理對植物Cd吸收的影響

AM真菌修復(fù)作為一種高效、無污染的重金屬修復(fù)技術(shù)，其吸附、固持重金屬，修復(fù)污染土壤的能力受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［18-20］。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬通過AM真菌菌絲的吸收作用，被固定或運輸?shù)街参矬w內(nèi)。在某些情況下，AM真菌有助于重金屬在菌絲壁和土壤中的固化和吸附［21-23］。AM真菌通過與大多數(shù)植物的根建立共生關(guān)系，提高植物根系吸收面積［24］，促進植物光合作用［25］，改善植物的營養(yǎng)狀況和生理代謝水平［26-27］，在重金屬衰減過程中發(fā)揮作用。王凱淵等［28］研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌可以顯著提高桑（Morus alba）株生物量和礦質(zhì)營養(yǎng)的積累，促使Cd集中在根部，與Cd濃度存在顯著正相關(guān)關(guān)系，且具有不均勻的分布、遷移的規(guī)律。本試驗通過AM真菌與黑麥草對重金屬污染土壤的聯(lián)合修復(fù)，發(fā)現(xiàn)AM真菌聯(lián)合黑麥草可以促進對土壤中Cd的吸收，且不同AM真菌種類對Cd的吸收效果不同，其中FM處理效果較好。但對于不同AM真菌與植物形成共生體所表現(xiàn)的差異性還需進一步試驗研究。

3.2 AM真菌處理對植物光合熒光和生長的影響

AM真菌能促進重金屬Cd脅迫下植物的生長。接種AM真菌對黑麥草株高、干物質(zhì)重量、植物N含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒釬v/Fm值和Fv/Fo值、光合參數(shù)（Pn、Tr、Gs）以及生理活性的提高具有顯著效果。葉綠素是植物進行光合作用的主要物質(zhì)，代表植物光合潛力。在本試驗中，隨Cd濃度（0～30 mg·kg-1）的增加，葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是Cd影響了葉綠體的合成途徑，一些葉綠素合成酶的缺失或者活性降低使葉綠素快速分解。Pn、Tr、Ci、Gs是評價植物進行光合作用強弱的最直觀的指標(biāo)。本試驗中，隨著Cd濃度的增加，Pn、Tr和Gs逐漸降低，這表明與Cd脅迫下葉綠素含量的降低有明顯關(guān)系；Ci增加，表明在Cd脅迫下，非氣孔因素是影響植物光合作用的決定因素，這與鐵得祥等［29］在研究不同Cd濃度下楨楠（Phoebe zhennan）幼樹光合變化的情況一致。本試驗條件下，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值、Fv/Fo值表現(xiàn)一定的下降趨勢，表明Cd脅迫能抑制PSⅡ光合活性以及電子運轉(zhuǎn)等過程。接種FM、GV以及FM+GV后，黑麥草根系與菌絲緊密集合，促使根系吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，進而提高葉綠素含量，增強光合作用。對于其他光合作用相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢還需進一步試驗證明。

3.3 AM真菌處理對植物N吸收和生理酶活性的影響

植物在儲存和轉(zhuǎn)移能量、光合作用、生理酶活性調(diào)節(jié)和碳水化合物的運輸?shù)冗^程中都需要N［30］。本試驗發(fā)現(xiàn)，菌根植物對N的吸收顯著高于非菌根植物。AM真菌通過促進N吸收，并向寄主傳遞一定比例的N，提高了寄主植物的營養(yǎng)狀況。胡振琪等［31］發(fā)現(xiàn)接種菌根后苜蓿（Medicago sativa）的地上部N、P、K含量和地下部的N吸收量明顯高于其他處理和空白對照，證實AM真菌能夠促進苜蓿的養(yǎng)分吸收。因此，菌根真菌可以通過提高N的吸收，在污染土壤的植物修復(fù)中發(fā)揮重要作用。此外，當(dāng)植物生長發(fā)育的過程中受到不良條件侵害時，細(xì)胞膜會迅速做出反應(yīng)，調(diào)節(jié)和控制物質(zhì)運輸以及能量的交換，其中超氧根（O2-）以及羥基（OH-）等物質(zhì)對植物生長產(chǎn)生抑制作用，造成膜脂過氧化以及抗氧化酶失活等問題。植物本身存在防御系統(tǒng)，其中SOD、POD等防御性酶以及可溶性蛋白等物質(zhì)會修復(fù)細(xì)胞系統(tǒng)，維持植物體平衡。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著Cd濃度的增加，SOD活性和可溶性蛋白含量顯著下降，而POD活性和MDA含量則顯著增加，表明重金屬Cd脅迫下植物細(xì)胞中的O2-以及OH-等物質(zhì)會使SOD活性降低，可溶性蛋白合成途徑受阻。而接種AM真菌能緩解Cd脅迫，增加SOD、POD活性和可溶性蛋白含量，這主要是因為菌根共生體幫助寄主植物吸收N等營養(yǎng)物質(zhì)，龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)延長了根系吸收范圍，加強對O2-以及OH-的清除能力。

4 結(jié)論

由上可知，AM真菌通過與黑麥草建立共生關(guān)系，改善植株營養(yǎng)狀況，促進對N的吸收，增加植株體內(nèi)的葉綠素含量以及PSⅡ光化學(xué)熒光參數(shù)，同時增強了黑麥草葉片凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，顯著增加植株的生物量。此外，AM真菌主要通過根系吸附固持重金屬Cd的能力，降低Cd自下而上的轉(zhuǎn)移能力，從而減輕重金屬Cd的毒害能力。供試條件下，F(xiàn)M+GV處理的黑麥草抗Cd能力較強，改善植物光合和生理效應(yīng)較為顯著。