基于文獻計量分析的國內外根際土壤微生物研究進展

鄧增卓瑪，馬文明，周青平，迪力亞爾·莫合塔爾，侯 晨，唐思洪

（西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041）

根際是指受根系分泌物的影響，其土壤理化性質和生物活性與原土體明顯不同，并且靠近植物根系的狹小土壤區域［1］。由于其獨特的微環境，為微生物的大量增殖創造了條件［2］。根際微生物是土壤生態系統中極其重要的組成部分，參與土壤生態系統中生物化學循環和能量流動，包括碳、氮、磷和硫等養分的循環和土壤有機質的分解［3］。并且根際微生物一直以來被認為是植物的第二基因組，對植物的生長發育有著不可替代的作用。植物和根際微生物的互作被喻為“超級生物”［4］，經過長期協同進化，植物與根際微生物形成一種互惠互利的共生模式，植物根系分泌有機物質為微生物提供能量，而微生物代謝并產生一些信號分子、植物激素或通過活化營養物質促進植物生長發育［5］。近年來國內外對植物和根際微生物之間互作關系的研究越來越多，涉及了植物與微生物共生，如植物與植物根際促生菌（PGPR）和菌根真菌互作。此類微生物通過抑制疾病［4，6］、增加營養利用率［7］和降低非生物脅迫［8-9］等提高植物生產力；還包括一些抑制植物生長的有害微生物的研究，如尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）造成植物根系部位生理活動的異常，植物吸收養分的能力下降，最后甚至造成全株死亡［10］。因此，了解植物-微生物之間的復雜關系，對生態系統環境的改善和生產力的提高等具有重要意義。

文獻計量分析作為整理文獻脈絡的方法，對探索大數據平臺下的研究知識圖譜意義重大。引文空間（CiteSpace）是美籍華人學者陳超美博士于2004開發的一款主要用于分析科學文獻數據的信息可視化軟件，可以用來制作科學和技術領域發展的知識圖譜，有效地幫助研究者更好地了解他們所從事的研究領域，還可以突出該領域發展過程中的一些重要文獻、熱點研究和前沿方向［11］。本文通過對國內外根際微生物近10年的文獻進行分析，對關鍵詞進行聚類可知，發現植物和非生物因子對根際微生物的相互作用以及根際微生物研究方法是近10年土壤微生物領域中關注度較高的領域。因此，本文從植物和非生物因子對根際微生物的影響為切入點，闡述了植被類型、植被生長期、根系分泌物和非生物因子對根際微生物的影響以及根際微生物對植被的正負反饋作用，總結了微生物可培養技術的優缺點，以期為根際微生物的研究提供理論依據。

1 數據來源及方法

1.1 數據來源

本文以美國科學情報所的Web of Science數據庫核心集合和中國知網（CNKI）為數據來源。文獻檢索時間為2011～2021年，由于2021年文獻繼續入庫，所以截至時間為2021年4月13日，Web of Science中 檢 索 主 題 為：“rhizosphere microbes”或 “rhizosphere microorganism”，語言類型限定為“english”，文獻類型為“article”、 “review”，學科領域為“environmental science”、“soil science”、“ecology”和“microbiology”，并且過濾“book review”和“note”等類型的文獻，得到英文文獻共2240篇。在CNKI以“根際微生物”為關鍵詞，經過篩選，刪除與關鍵詞無關的文獻，得到中文文獻共1702篇。

1.2 方法

將CiteSpace V分析時間段設為2011～2021、跨度為一年、節點類型選擇關鍵詞，年被引頻次排名為50，其他參數默認，生成文獻共被引圖譜，并進行分析，其中通過對數似然比算法（LLR）（聚類標簽詞提取算法之一）對共被引文獻的關鍵詞進行聚類，可得出共被引文獻聚類知識圖譜。

2 關鍵詞聚類分析

關鍵詞是一篇文章的核心，在學科領域出現的高頻關鍵詞往往被視為熱點研究領域。關鍵詞共現分析是CiteSpace的基本功能之一，它可以通過分析文獻中出現的關鍵詞來判斷文獻之間的關系，展示學科的研究結構［12］。因此，關鍵詞的提取可以幫助我們了解當前研究方向的熱點和趨勢。關鍵詞的聚類更注重反映聚類間的結構特征，突出聚類之間的關鍵點和重要聯系［13］，并且每個聚類中節點標簽反映了其核心的研究內容。由圖1和2可知，對關鍵詞聚類后，分別形成12和17個聚類標簽，并且國內外近10年根際微生物研究均以根際微生物（國內：#7、#9、#12；國際：#1、#3、#4、#5、#6、#11、#15、#16）、根際微生物與植被的相互作用（國內：#0、#1、#3、#5、#11；國際：#0、#9、#12、#14）較多。還有微生物研究方法（國內：#6；國際：#12）和環境因子（國內：#2、#8；國際：#2）也是近幾年的研究熱點。

圖1 國內根際微生物關鍵詞聚類知識圖譜

圖2 國際根際微生物關鍵詞聚類知識圖譜

3 根際微生物

根際微生物是連接土壤-微生物-植物系統中最大的生命群體［14］，它是指黏附在根際土壤顆粒中的微生物。在根際這個微生境中，植物根系的生理活動，使周圍土壤的物理和化學性質發生改變，豐富了土壤有機質，進而為微生物的大量增殖創造了條件［2］。微生物及其產物也以各種積極的、消極的和中性的方式與植物的根系相互作用，影響植物的生長發育，改變養分動態，也改變植物對疾病和非生物脅迫的敏感性。

3.1 植被對根際微生物的影響

3.1.1 植被生長期對根際微生物的影響

根際微生物的數量受植被年齡（或生長階段）的影響，不同生長期其數量和密度存在著一定的差異。孫海明［15］對羊草（Leymus chinensis）草原根際土壤微生物進行研究，結果表明不同生長期的環境因子是影響根際細菌、真菌和放線菌數量的主要因素，土壤溫度和含水量低，微生物生長速度緩慢，數量相對較少。隨著土壤溫度和水分含量的增加，根際細菌、放線菌和真菌逐漸進入生長期和繁殖期，數量逐漸增加。邱立友等［16］發現，在烤煙的整個生長期中，根際微生物的數量在旺長期最多，成熟期和采收期次之，團棵期最少。這主要與烤煙根系的生長代謝活性和土壤溫度有關。曾齊等［17］研究發現，隨著大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］生育期的推進，土壤有機質含量逐漸減少，微生物的生長繁殖受到抑制，因此，栽培大豆和野生大豆根際細菌的數量均在分枝期最多，結莢期時有所下降，到成熟期數量最少。不僅根際微生物的數量隨著植物生長階段發生變化，群落組成也隨之改變，大部分研究者認為這與植物在不同生長階段根系分泌物組成與數量有關。例如，在幼苗期植物分泌糖類可以吸引大量微生物，而在后期，植物分泌更多的酚類物質對微生物群落進行選擇，抑制了部分微生物的繁殖［18］。因此，根際微生物群落組成隨之發生變化。

3.1.2 植被類型對根際微生物的影響

不同植物甚至同一物種的不同基因型，通過不同的根系分泌物，進而影響植物根際微生物的招募過程［19］，使得根際微生物的種群密度、數量和群落在不同的植物類型和基因型也有一定的差異。馬曉梅等［20］研究發現，胡楊（Populus euphratica）和檉柳（Tamarix chinensis）在根際細菌、真菌和放線菌的數量上均存在明顯差異。王少昆等［21］研究發現，不同的灌木對不同根際微生物的生長有不同的影響，細菌在冷蒿（Artemisia frigidaL.）和小紅柳（Salix microstachyaL.）的根際生長旺盛，放線菌在小紅柳和差巴嘎蒿（Artemisia halodendronL.）根系周圍數量較多，小葉錦雞兒（Caragana microphyllaL.）和差巴嘎蒿為真菌生長繁殖提供有利環境，從總體上，4種灌木都有較強的根際正效應。外來物種的入侵，可以從另一個角度證明植物種類對根際微生物的影響。李國慶［22］種植外來物種加拿大一枝黃花（Solidago canadensisL.）后，發現其根際微生物中細菌群落的優勢種群為放線菌綱（Actinobacteria）鏈霉菌屬（Streptomyces），而土著種的優勢種群仍然是α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），并且加拿大一枝黃花中鏈霉菌屬代謝過程產生的抗生素通過抑制其他菌群的生長，使細菌種群的多樣性明顯降低。Bouffaud等［23］研究表明，玉米（Zea maysLinn.）根際細菌群落組成受到玉米品種基因型的影響，且群落結構的改變主要表現為某些β變形菌屬（Betaproteobacteria）和特定伯克氏菌屬（Burkholderia）的變化。Aira等［24］研究發現，負責植物碳分配的2個基因（su1和sh2）使根系分泌物發生了變化，進而改變了玉米根際微生物群落的結構和活性，但是對其優勢菌的生物量并沒有發生顯著變化。然而，也有研究表明植物對根際微生物群落結構影響不顯著。Singh等［25］在同一地點的土壤中種植3種禾草，以確定植物特異性對根際微生物群落的影響，發現不同植物根際土壤細菌群落組成具有相似性，表明植物種類對根際微生物群落結構的影響較小。付合才［26］以4種暖溫帶典型落葉櫟林的優勢種和建群植物為研究對象，發現不同櫟屬植物的根際細菌群落組成和豐度差異也并不顯著。

3.1.3 根系分泌物對土壤微生物的影響

根系分泌物是指在植物的生長過程中，植物不同的根系部位通過各種方式釋放到土壤中的復雜有機物質的總稱［27］。主要來源于健康的植物組織釋放和殘根等衰老組織的分解2個方面，包括由根細胞擴散產生的低分子有機質、根系代謝形成的分泌物、根系脫落形成的高分子黏膠質以及殘體的分解物4大類［28］。根系分泌的各種初級代謝產物和次級代謝產物，能夠通過塑造、傳遞信號或干擾等作用來影響根際微生物區系［29］。如黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）根系分泌物（茉莉酸和水楊酸）通過誘導植物免疫反應，從而調節微生物群落［30］。苜蓿（Medicago sativa）可以產生一系列特殊的三萜，指導特定微生物群的組裝和維護，使其能夠根據自身的目的塑造和調節其根內和根系周圍的微生物群落［31］。研究者還發現，豆科植物通過分泌黃酮類化合物（2-phenyl-1，4-benzopyrone derivatives）與根瘤菌（Rhizobium）進行信號交流，這類物質在根瘤菌激活蛋白的作用下，能誘導結瘤基因的表達［32］，從而形成根節瘤，根節瘤為根瘤菌的繁殖提供了活動場所和營養物質。除此之外，植物根系還可以通過分泌碳水化合物和氨基酸等來誘導PGPR的定殖。Rudrappa等［33］等研究發現，當擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉面病原菌侵染根際時，根系分泌物中釋放的蘋果酸可招募PGPR枯草芽孢桿菌在根際的定殖。進一步研究發現，枯草芽孢桿菌通過激活擬南芥中的脫落酸和水楊酸信號通路，導致氣孔關閉，從而限制病原體入侵。植物根尖向根際釋放的緣細胞和黏液中含有大量的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs），這些AGPs能夠不僅吸引有益微生物（細菌和真菌），而且還對植物根際病原菌具有一定排斥作用［34］。

3.2 非生物因子對根際微生物的影響

土壤環境作為微生物的棲息地，對微生物群落結構和多樣性有著重要的影響。非生物因素土壤養分、pH、含水量、溫度等都被認為是影響根際微生物群落組成的重要因子。土壤養分及其生物有效性對根際微生物的多樣性和豐度有直接和間接（通過植物）的影響［35］。如熊藝等［36］對小麥根箱試驗的研究表明，缺氮使小麥根系分泌有機物質的質量和數量發生變化，抑制了硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等氨氧化微生物的繁殖，但增加了富營養菌厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度。另一種重要的土壤養分磷，也是根際微生物群的調節因子。Beauregard等［37］利用磷脂脂肪酸和變性梯度凝膠電泳分析了施磷8年對單一栽培紫花苜蓿土壤微生物多樣性的影響。結果表明，施磷改變了真菌和細菌群落的結構，但對物種豐富度沒有影響。在農業生產中，農作物生產力的主要制約因素之一是土壤養分的貧瘠，這主要取決于3種大量元素氮、碳和磷的含量。一般土壤營養的缺乏可以通過施肥來緩解。施用有機肥可以提高幼苗生物量，顯著提高土壤微生物和土壤酶活性［38］。有機肥可以塑造茶葉根際微生物組成，使根際有益細菌包括伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和鏈霉菌目（Streptomycetales）的數量增加［39］。而長期施用化肥會導致嚴重的土壤酸化、營養失衡和根際微生態環境惡化，進一步增加土壤重金屬離子的活性，影響根際微生物的數量。Li等［40］對玉米農田的研究表明，高氮肥量（N 312 kg·hm-2）的輸入導致土壤pH大幅下降，從而加劇了土壤酸化，導致根際周圍的環境不利于細菌生長，使得根際細菌多樣性普遍較低。pH也是影響細菌多樣性的關鍵因素。pH接近中性的土壤細菌群落多樣性最高，因為當pH偏低或偏高時，細菌的代謝活性和增長率受到影響，當一種微生物增長率下降到25%時，由于種間競爭的存在，會使其滅絕［41］。土壤pH還會間接通過影響養分有效性以及根系分泌物量和組成，間接影響細菌群落結構。在干旱環境中，細菌多樣性被認為受到溫度的變化、紫外線輻射的升高、低營養元素含量和低土壤水分含量的影響［42］。干旱使植物根際促生長細菌放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的含量增加，兩者都與促進植物的生長有關［43］。根際的溫度主要影響不同微生物的生長速度。如Pietikainen等［44］發現，無論何種土壤類型，真菌和細菌在25～30℃之間生長速度最快，在30℃以上，細菌相對于真菌的生長速度較快，而細菌則受較低溫度的影響更大，根際真菌與細菌的比值在低溫時升高，在溫度升高時則降低。

3.3 根際微生物對植物的影響

根際中存在著大量對植物有益和有害的根際微生物（表1）。植物根際有益微生物主要通過其各種生命活動促進植物的健康生長。如植物PGPR和菌根真菌等。根際有害微生物（DRMO）是指微效病原菌范圍內，靠其生物代謝而非寄生來抑制植物生長發育的一類根際微生物［45］，包括有害根際細菌（DRB）和有害根際真菌（DRF）。然而，在根際細菌分類上，無論是DRB 或PGPR還沒有明確的界定。

3.3.1 植物根際促生菌

植物PGPR是植物根際一類重要的微生物，通常與根表面作用，通過酸化或螯合等作用增強礦物質營養的吸收、細菌代謝產生植物激素、誘導植物抗性系統和產生抗生素來抑制病害等多種機制促進植物生長［73］。PGPR能將土壤中難溶性礦物質分解并將其轉化為易于被植物吸收的化合物，從而有助于保護植物免受營養脅迫。如土壤中磷元素以不可溶的形式存在，在根際中磷酸鹽溶解細菌分泌的有機酸和磷酸酶改變磷的溶解性，促進植物吸收。甚至一些促生菌能夠將外界環境中的氮轉化為有機氮，供給宿主植物吸收利用。植物PGPR產生的植物激素包括生長素（IAA）、赤霉素（GAs）和細胞分裂素（CTK）等［74］。研究表明，植物根系獲得根際周圍促生菌合成的外援吲哚 3-乙酸（IAA），從而能夠促進根系的生長和分枝［75］。IAA還可以通過與質膜上的質子泵結合而被激活，改變細胞內環境，從而使細胞壁糖溶解，增加細胞的可塑性，進而增大細胞體積和促進RNA蛋白質的合成，以達到促生作用［76］。CTK通過促進細胞分裂和細胞擴大，影響側根和不定根的形成，因此對植物根系的形成和根系表面積的增加有一定的正向作用［77］。GAs是另一類植物激素，存在于從植物發芽到衰老的所有發育階段。然而，GAs最重要的生理效應是促進芽的生長。PGPR對病原體的抑制主要通過產生抗生素和抗真菌代謝產物、溶解酶和誘導植物防御反應［78］。例如，抗生素吩嗓酸和2，4—二乙酞藤黃酚是熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）最主要的2種次級代謝產物，對預防和治療小麥全蝕病菌Ggt所引起的小麥全蝕病有著重要作用［79］。在一些極端環境，如干旱、重金屬、鹽堿等脅迫下，PGPR能誘發植物抗性系統的反應，引起相關抗脅迫基因的表達上調，從而減輕逆境對植物的傷害［80］。

3.3.2 菌根真菌

真菌與植物根系之間最常見的共生關系是菌根共生，而最常見的菌根真菌為叢枝菌根真菌（AMF）和外生菌根真菌（ECM）。叢枝菌根是農業作物物種形成的菌根類型，菌根真菌經過根皮層的生物營養定殖后，形成一種外部菌絲，它是連接根與周圍土壤微生境的橋梁［81］。叢枝菌根與保護植物免受生物脅迫有關，如AMF通過與根系的病原真菌競爭入侵位點和營養物質，阻止病害相關蛋白的合成，從而提高寄主植物的抗病能力［82］。反過來，相關的真菌從宿主根中提取脂類和碳水化合物作為養分來源。還有研究表明，接種AMF能夠促進宿主植物對磷的吸收，改善植物體內的磷營養缺乏狀況，進而促進植物的生長發育［83］。蔡曉布等［84］對草地植物穗序剪股穎（Agrostis hugoniana）和紫羊毛（Festucarubra）分別接種2種AMF，即根內球囊霉（Glomus intraradices）和摩西球囊霉（Glomus mosseae），發現二者均能顯著促進植物根系對土壤中磷的吸收和利用。鹽漬化土壤環境會降低植物對水分的吸收，引起植物生理干旱，而AMF不僅可通過菌絲的生長擴大根系的吸收范圍，而且還能通過促進宿主植物根系生長，提高對水分的吸收速率，阻止寄主植物體內的水分流失，減輕鹽脅迫造成的傷害［85］。外生菌根是真菌在植物根部皮層細胞間隙發育形成哈蒂氏網在根尖形成菌套結構的共生體［86］。植物形成這種共生體后，可以提高對一些極端環境的耐受力。王琚鋼等［87］認為，干旱脅迫下，ECM可以更好地利用30 cm以下的土壤水分，從而減緩干旱脅迫。ECM還可以保護寄主植物免受重金屬的毒害［88］。為了應對這種毒性作用，生物擁有不同的防御機制，如減少攝取細胞外的金屬螯合劑，細胞內的金屬螯合配體如谷胱甘肽的細胞溶質、金屬硫蛋白和分割液泡［89］。特定螯合劑的合成和隨后的金屬配合物的螯合對于限制游離金屬濃度具有重要意義。

表1 根際微生物的生態功能

3.4 有害根際微生物

有害根際細菌（DRB）以氰化物、植物激素、鐵團和植物毒素的形式排泄出多糖和其他化學物質，可對植物的代謝產生負面影響，具體表現在種子萌發減少、生長抑制、根系伸長減少、根系變形和/或變色，以及根系定植真菌的感染增加［90］。氰化氫的產生在根際假單胞菌中最為常見，從馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）和小麥根瘤菌中分離出的假單胞菌約有50%能在體外產生氰化氫［91］。氰化物可以抑制由細胞色素氧化酶呼吸介導的ATP產生。這種抑制導致線粒體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化釋放的電子沿著耐氰呼吸途徑進入氧氣。因此，大量能量以熱量的形式損失，而不是用于ADP的磷酸化［92］，減少了用于根系養分吸收的熱量。Loper等［93］發現，當接種在甜菜（Beta vulgarisL.）種子上時，2種腸桿菌的菌株產生了足夠數量的IAA以減少根系的伸長。

3.5 根際微生物可培養技術

近幾十年來，盡管微生物研究技術一直在不斷完善，大部分微生物由于在自然界的豐度較低、微生物之間復雜的合作關系、實驗室無法模擬特定的環境條件等導致難以分離和培養，成了微生物中的暗物質［94］。這些未培養的微生物在碳、氮和其他元素的循環以及對周圍的生物和環境有著重要影響。培養微生物的傳統方法側重于使用營養豐富的培養基，創造有利于快速生長微生物的環境［95］。然而，營養豐富的培養基可能對那些在營養不良條件下生存的微生物有毒害作用。還有一些共生微生物在沒有輔助因子和輔助菌株的生長環境中無法進行生長。為了解決這些問題，科學家通過一些新的方法，如原培養、細胞分選技術和微流控芯片技術等克服傳統方法的缺點，用于培養以前未培養的微生物，以評估和監測微生物生理活動和功能。在實驗室模擬微生物原生長環境的擴散室、擴散生物反應器和分離芯片（iChip）等原位培養技術，可以使生長因子擴散，但細胞不能擴散。在這種環境下，細胞可以從其自然環境或共生微生物處獲得必要的生長因子，同時進行隔離復制，形成理想的菌落［96］。此外，被分離的微生物產生的潛在生長抑制代謝物可以自由擴散，而不是在局部積累。以這種方式模擬原生長環境，避免了傳統培養基過量營養物質對某些物種的生長有害。雖然相對于傳統方法，原培養技術更有效地提高未培養微生物的數量，使得大量的稀有微生物得到培養，但由于其可控性較差，會影響后續的分離效率。細胞分選技術包括光學鑷子和熒光活化細胞分選（FACS）等用于從混合群落的細胞懸液中分離單細胞，消除種間競爭，使得未培養微生物得到繁殖，進一步通過微生物和基因組之間的聯系揭示以前未發現的微生物功能［97］。FACS的原理是當單個細胞有序地通過激光束時，目標生物細胞中的熒光標記被激發，這些熒光信號代表了獨特生物標記物，從而完成對細胞物理和生化特性的分析與分選。雖然，FACS系統由于以單細胞為基礎分離目標細胞，從而具有更高的分選精度。但是其復雜的分選機制使目前的FACS系統昂貴和笨重，而且在分選過程之前，在開放的環境中產生的氣溶膠會對環境造成潛在的污染。微流控芯片技術可以在多種基質存在或不同物理化學條件下操作來自環境樣品的大量單個微生物。滑動芯片［98］是將微生物分別接種在數千個微孔培養板中，這些微孔培養板可以包含各種介質和基質，微生物繁殖成功后，將每個微孔培養板分成2個，形成2個相同的培養物。然后，在一個培養板的微生物可以被單獨篩選以進行生長和/或分類鑒定，而在另一個培養板中的微生物以繼續培養。微流控芯片技術能同時檢測到多種不可培養微生物的存在，分析速度快，還可以獲得目標微生物的純培養，為后續微生物生理生化特性的分析提供了條件。但是由于其在完全密封的室內隔離培養單個微生物，許多依賴共生菌的代謝產物生長的微生物很可能無法成功培養。

4 展望

4.1 根際微生物組成對植被-微生物互作的影響

根際微生物積極的參與植物根系-土壤復雜的相互作用中，并且對地上植物的生長、健康和適應性至關重要。然而，我們仍然缺乏關于這個復雜相互作用中不同微生物參與的信息。因此，還需要通過測序等技術使我們能夠更有效地探索土壤微生物群落結構及其基因，有助于更好地證明土壤微生物群落和功能的變化。進一步通過研究和比較微生物共生網絡來量化微生物共生模式，對研究其復雜的機理也顯得格外重要。

4.2 根系分泌物對土壤微生物的選擇機理

根際是國內外的研究熱點，目前已經從根際微生物、根系分泌物等方面進行了系統深入的研究。不同根系分泌物對某些土壤微生物具有招募作用，這類趨化性的細菌或真菌就能夠在根系周圍大量聚集和繁殖。如擬南芥根系分泌的三羧酸循環中間l-蘋果酸以劑量依賴的方式招募有益枯草芽孢桿菌FB17（Bacillus subtilisFB17）［33］。再如豆科植物誘導根瘤菌的繁殖和生長，而對有些病原菌的生長具有抑制作用。因此，植物根系分泌物如何具體調節土壤微生物，還需要從分子、生理和生態水平上進一步深入研究，以改善植物生產力。

4.3 微生物暗物質的研究方法

盡管微生物研究技術一直在不斷完善，但是環境中仍存在大量無法分離和培養的微生物暗物質。這些暗物質可能代表了生命系統發育樹的主要進化線，并被認為在生態系統的形成、進化和功能中發揮了關鍵作用。傳統方法與現代方法都有優缺點，將多種方法結合使其互補，有利于微生物暗物質的分離和培養。如Liu等［99］將熒光激活細胞分選技術（FACS）與分離芯片（iChip）進行整合，用于水稻土壤微生物的研究，表明8個FACS-iChip平板共培養了19個屬近500株的菌株，但通過16S rRNA基因擴增，僅鑒定出6個屬。再如通過增加營養物質濃度和熒光原位雜交鑒定與培養了納鹽古菌門（Nanohaloarchaeota）中第一個微生物［100］。因此，結合多種方法（常規培養方法、共培養、反基因組、高通量培養技術等）對微生物暗物質進行多角度、大規模和綜合性的研究，以探索各種自然環境，特別是極端棲息地的微生物組，拓展我們對微生物的分類和功能多樣性的認知。同時通過加強研究物種及功能之間的聯系，從而深入了解暗物質的生理機制。