不同土地利用方式土壤氨氧化微生物和反硝化微生物時空分布特征

蔡玉佳,沈菊培,張成軍,馮虞彥, DI Hongjie,賀紀正

1 福建師范大學,地理科學學院,福州 350007 2 西交利物浦大學,健康和環境科學系,蘇州 215123 3 北京農林科學院,植物營養與資源研究所,北京 100097 4 林業大學,環境科學與工程學院,北京 100083 5 新西蘭林肯大學, 土壤與環境研究中心, Canterbury 7674

氮是植物生長的重要營養元素之一,對農業生態系統具有重要作用。硝化和反硝化過程是氮循環主要過程,均為微生物所驅動,兩者共同調節植物和微生物可利用氮含量,也是土壤N2O產生的主要途徑[1]。氮循環過程受多種因素的影響,包括氣候,土壤類型,施肥和土地利用方式等[2—3]。土地利用方式通過改變土壤理化性質和養分有效性等影響地上地下生態系統功能。Shen等[4]研究了酸性紅壤在5種不同土地利用方式下古菌和氨氧化微生物,發現土地利用方式顯著影響古菌群落結構,且氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea, AOA)對土地利用方式變化的響應比氨氧化細菌(Ammonia oxidizing bacteria, AOB)敏感。Liu等[5]研究發現灌區撂荒地和農耕地表層和底層土壤氮轉化速率和氨氧化微生物數量存在顯著差異,農耕地土壤的AOA和AOB數量顯著高于撂荒地。Zulkarnaen等[6]研究了我國亞熱帶紅壤地區林地和旱地農田土壤中的硝化作用,結果表明旱地土壤AOA和AOB數量和凈消化速率高于林地土壤,但二者的N2O排放速率沒有顯著差異。可見,土地利用方式的改變對土壤硝化過程的影響還沒有統一的定論,特別對驅動氨氧化和反硝化過程的微生物群落的季節影響還有待深入[4]。本文主要對比分析農田和林地兩種土地利用方式下氨氧化微生物和反硝化微生物的季節變化特征,可為預測土壤硝酸鹽淋溶和環境氮損失提供參考。

土壤是異質性較高的體系,其生物和化學性質在不同剖面上存在顯著差異。深層土壤氧含量較低,溫度變化小,土壤溶液或水分停留時間較長[7]。在灌溉和降水的水力驅動下,硝酸鹽和活性溶解性有機碳組分將向深層土壤遷移,改變深層土壤養分組成[8—9],進而影響土壤微生物群落。由于表層土壤的微生物生物量大,活性高,當前對其生物地球化學過程的研究給予了極高的關注。有研究表明深層土壤儲存著大量的有機碳,且具有相當豐富和多樣的土壤微生物。40—200 cm土壤的微生物量可占200 cm土壤剖面微生物全量的35%,這些深層土壤微生物在土壤成土過程、污染物降解和維持地下水水質等生態功能方面具有重要作用[10]。因此,研究不同土地利用方式下硝化、反硝化微生物沿土壤剖面的動態變化對認識硝酸鹽的垂直淋溶過程具有重要的實踐指導意義。

目前對不同土地利用方式下土壤氮轉化過程及微生物機制已有不少研究,但對土壤硝化和反硝化微生物的時空分布特征的認識還不夠。本文通過采集華北平原典型潮土兩種土地利用方式0—100 cm的剖面樣品,研究玉米地和林地土壤氨氧化微生物和反硝化微生物豐度垂直分布特征,并探討其與剖面土壤硝酸鹽的關系,旨在為調控和減少硝酸鹽淋溶風險、降低土壤N2O排放提供重要的理論指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地點位于北京市延慶區某奶牛養殖場附近的玉米地和鄰近的次生林地(40°29′N,115° 56′E),土壤類型均為粉砂質粘壤土(美國制),容重為1.31 g/cm3。該地區屬于典型大陸性季風氣候,年平均溫度為8℃,年平均降水量為400—500 mm,降水集中在7—9月(夏季),占全年降水量的70%[11]。樣地附近某奶牛養殖場已經營十年,圈養奶牛200多頭,每年所產牛糞(約4000 t)作為基肥施用于臨近玉米地。本研究選取了該處理下大小一致的三塊玉米地(200 m×200 m),同時采集了鄰近未施用牛糞的次生林林地土壤。該次生林在2004年實施退耕還林之前的土地利用方式和土壤母質與玉米地一致。采樣時間為2018年春季玉米種植之初(5月初)和秋季收割之后(9月底)。

采用“S”型采樣法在每塊地選取5個采樣點,用管型土鉆采集0—20、20—40、40—60、60—80、80—100 cm深度的土壤,每層5個采樣點分別混合均勻為一個土壤樣品,共采集得到60個土壤樣品(即2個土地利用方式×3個重復×5個土層×2個季節)。去除土壤樣品中的植物殘體和碎石后于采集當天送至實驗室,過2 mm篩后分為兩部分：一部分存于4℃冰箱用于土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢測定和后續土壤理化分析；另一部分存于-40℃冰箱,用于提取土壤DNA。

1.2 土壤基本性質測定

土壤pH使用pH計(METLER TOLEDO FE20)以土水比1∶1測定。土壤有機質測定采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法。利用元素分析儀(Vario EL III, Elementar)上測定土壤總氮含量。土壤溶解性有機碳和溶解性有機氮含量的測定過程如下：稱取5.0 g鮮土用0.5 mol/L K2SO4溶液以1∶5的土水比浸提,離心過濾后,在總有機碳/總氮分析儀(Multi N/C Model 3100, Analytic Jena, Germany)上測定。土壤銨態氮和硝態氮用1 mmol/L KCl溶液以1∶5的土水比浸提,離心過濾后,流動分析儀(AA3, SEAL, Germany)測定。土壤基本性質見表1。

表1 春秋兩季玉米地和林地土壤剖面基本性質

1.3 土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢測定

1.4 土壤DNA提取

稱取0.50 g冷凍樣品,利用土壤DNA試劑盒(DNeasy Power Soil Kit, QIAGEN, Germany)根據說明書提取土壤DNA并在NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop, Thermo Scientific, USA)上測定DNA濃度和純度,隨后保存于-40 ℃下用于后續分析。

1.5 土壤細菌和氮功能基因豐度測定

通過實時熒光定量PCR方法,在LightCycler 480II(Roche, Switerland)上測定細菌16S rRNA基因、AOAamoA、AOBamoA、反硝化nirS、nirK和nosZI基因的豐度。細菌16S rRNA基因豐度采用TaqMan探針法,氮相關功能基因豐度的測定采用嵌合熒光法檢測法。PCR擴增體系為20 μL,內含10.0 μL Premix Ex Taq II(分別為PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, TAKARA, Japan和SYBR Green Supermix, BIO-RAD, USA),0.5 μL或1.0 μL前引物和后引物,1.5 μL或2.0 μL DNA模板,用超純水補足(RNase-free)。定量PCR引物序列信息、PCR擴增程序及標線制作見袁超磊等[14]。定量PCR標線的擴增效率在90%—100%范圍,標準曲線R2>0.99并通過凝膠電泳檢驗PCR產物。

1.6 數據分析

采用SPSS 16.0對數據進行單因子、多因子方差分析。采用R語言“vegan”,“Hmisc”,“corrplot”包等對硝化活性、氮功能基因豐度與土壤理化性質之間的關系進行冗余分析(Redundancy Analysis, RDA)和Pearson相關分析。冗余分析中膨脹因子大于10的環境因子沒有呈現。采用SigmaPlot 10.0和R的“corrplot”包作圖,P<0.05差異檢驗顯著。

2 結果與分析

2.1 玉米地和林地土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢時空分布特征

圖1 春、秋兩季玉米地和林地不同土層的氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢

2.2 玉米地和林地土壤細菌和氮循環功能基因豐度時空分布特征

圖2為不同土地利用方式下細菌16S rRNA基因、氨氧化微生物(AOAamoA、AOBaomA)和反硝化微生物(nirS、nirK和nosZI基因)相關功能基因的垂直分布特征。土壤細菌和氮循環功能基因豐度均隨土壤深度增加而顯著降低(P<0.05)(圖2、表2)。玉米地沿土壤剖面各氮循環功能基因豐度范圍(拷貝數/g 干土)分別為AOAamoA基因 5.22×107—3.30×103,AOBamoA基因 5.62×107—1.0×103,nirS基因4.32×107—9.91×102,nirK基因4.62×107—2.97×104和nosZI基因6.25×107—2.70×103。林地土壤沿剖面則分別為AOAamoA基因7.67×107—1.39×103,AOBamoA基因5.52×106—1.0×103,nirS基因4.03×106—1.02×103,nirK基因5.49×106—2.69×104和nosZI基因4.75×106—3.29×103。整體上玉米地土壤氨氧化、反硝化微生物數量高于林地土壤。

圖2 玉米地和林地土壤細菌16S rRNA基因和氮循環功能基因豐度時空分布

單因子方差分析結果表明春季玉米地土壤AOBamoA、nirS、nirK和nosZI基因豐度顯著高于林地(P<0.01),而秋季樣品兩種利用方式間無顯著差異。玉米地AOBamoA(F=6.905,P<0.05)、nirS(F=9.791,P<0.01)、nirK(F=4.577,P<0.05)和nosZI(F=4.857,P<0.05)基因豐度在不同季節間差異顯著,且秋季氨氧化、反硝化微生物的豐度呈下降趨勢,而AOAamoA基因(F=3.017,P>0.05)在不同季節間無顯著差異。另外,季節變化對林地土壤氮循環功能基因沒有顯著影響(P>0.05)。多因子方差分析表明土地利用方式、季節變化和土壤深度對細菌豐度和氮循環功能基因有顯著影響,但各變量間的交互作用均不顯著(表2)。

表2 三因子PerMANOVA分析土地利用方式、季節變化、土壤深度及其交互作用對氨、亞硝酸鹽氧化潛勢和氮循環基因的影響

2.3 土壤理化因子與氮功能微生物基因豐度和功能的相關性

圖3為氨氧化、反硝化微生物豐度與土壤理化性質之間的冗余分析結果。土壤理化性質分別解釋了玉米地和林地氮循環微生物差異的48.7%和72.7%。玉米地的第1和第2排序軸解釋量分別為44.2%和3.5%,而林地的第1和第2排序軸的解釋量分別為69.9%和1.7%。如圖3所示,玉米地和林地土壤可溶性有機碳、可溶性有機氮、銨態氮、硝態氮與氨氧化、反硝化微生物豐度正相關,而土壤C/N比和pH與氨氧化、反硝化功能基因豐度顯著負相關。

圖3 玉米地和林地氨氧化、反硝化基因豐度和土壤理化性質的冗余分析(RDA)

Pearson相關性分析(圖4)表明土壤有機質、總氮、可溶性有機碳和可溶性有機氮含量與氨氧化、反硝化基因豐度、氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢顯著正相關,而土壤C/N比、pH與氨氧化、反硝化基因豐度、氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢顯著負相關。玉米地春季樣品土壤銨態氮、硝態氮含量與氨氧化潛勢顯著正相關,硝態氮含量還與AOBamoA、nirS和nirK基因豐度呈顯著正相關關系。林地土壤春季樣品銨態氮、硝態氮含量與氨氧化、反硝化基因豐度相關性卻不顯著。另外,玉米地秋季樣品銨態氮含量與AOBamoA、nirS基因拷貝數呈顯著正相關,而硝態氮含量與各功能基因豐度相關性均不顯著；而林地土壤硝態氮含量與氮循環功能基因豐度呈顯著正相關,相關系數大于0.5。

圖4 春、秋兩季玉米地和林地土壤理化性質與微生物豐度相關性分析

3 討論

土地利用方式的改變會引起土壤理化性質的變化,從而影響土壤微生物資源可利用性,最終改變土壤微生物包括病毒、細菌、古菌和真菌群落多樣性和結構[4,15—16]。本研究結果表明玉米地土壤養分含量、細菌和氮循環相關微生物的豐度顯著高于次生林土壤,這與前人的研究結果不一致。有研究發現天然林地轉變為人工林、耕地等方式后,土壤剖面有機碳儲量降低[17],而退耕還林,由于減少人為干擾后土壤有機碳含量增加[18]。Templer等[3]發現原始林地、農田及再生林土壤的氮轉化過程存在差異,即使再生林土壤的理化性質已與原始森林土壤接近,但其土壤微生物量氮、土壤呼吸速率、礦化和硝化速率均低于原始林地。引起結果差異的主要原因是農田土壤受外源物質輸入的影響。本文中玉米地的養分含量顯著高于次生林地主要長期受牛糞的影響,而林地土壤除大氣氮沉降外,無外源物質的輸入。牛糞等畜禽糞便作為一種良好的有機肥,含有豐富的易降解的有機碳、氮、磷和其它微量元素,如果管理和使用得當,極利于改善土壤肥力和健康,提高土壤微生物生物量[19]。以往長期施肥試驗研究結果表明,有機糞肥的施用可改善土壤養分條件,促進土壤微生物和氮循環微生物的生長,進而影響土壤氮轉化過程[20—21]。

通常認為氨氧化過程是硝化過程的限速步驟,然而在土壤環境受到干擾時亞硝酸鹽氧化過程也可成為硝化過程的限速步驟[31]。本研究測定了兩種土地利用方式下土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢,發現玉米地土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢顯著高于林地土壤,這與土壤氨氧化微生物豐度變化趨勢一致。相關性分析結果表明AOAamoA、AOBamoA基因豐度與氨氧化、亞硝酸鹽氧化潛勢之間存在顯著相關性(圖4)。蔡祖聰和趙維[32]觀測了不同土地利用方式對濕潤亞熱帶地區土壤硝化作用的影響,發現農用地的硝化潛勢高于自然土壤(森林和灌叢)。也有研究結果表明有機肥施用可顯著提高土壤氨氧化潛勢和亞硝酸鹽氧化潛勢[22, 33—34]。因此,不同施肥管理方式可引起氨氧化微生物發生變化,進而影響土壤氨氧化、亞硝酸鹽氧化過程。

硝化過程為反硝化過程提供底物,因此,硝化和反硝化過程通常耦合發生,共同作用并構成土壤氮素損失的主要途徑[3]。本文發現兩種土地利用模式下土壤硝化與反硝化微生物數量間均存在顯著的正相關關系。前人用Meta分析結果也表明硝化、反硝化微生物緊密相關,且其豐度分別與硝化、反硝化速率之間存在顯著的相關性[42],說明硝化、反硝化微生物的數量可間接反映硝化、反硝化速率。本研究中,玉米地土壤反硝化nirS、nirK和nosZI基因的拷貝數均顯著高于林地土壤。玉米地春季土壤各剖面層的nirS、nirK和nosZI基因豐度比對應的林地剖面土壤高1—2個數量級。在土壤剖面上,nirS、nirK和nosZI基因豐度均隨土壤深度增加而顯著下降。除林地秋季樣品外,各土層的nirS基因豐度均高于nirK基因,表明nirS型亞硝酸鹽還原微生物在亞硝酸鹽還原過程中起主導作用。此結果與Yuan等[43]報道的水稻土中nirS型反硝化微生物較nirK型具有更高的反應活性的結果較一致。一般認為潮土的砂粒含量較高,土壤有機碳含量較其它土壤類型低,通氣性好,不利于反硝化過程的發生。但是在深層土壤中,由于硝酸鹽的淋溶,底物充足,土壤氧含量低等因素,有利于反硝化過程的進行[42, 44]。RDA分析結果也表明土壤理化性質和反硝化基因存在明顯的關系,土壤有機質含量、溶解性有機碳、氮含量、銨態氮和硝態氮含量可解釋多數的變化豐富的反硝化功能基因。由于反硝化過程是一個耗能過程,微生物需要消耗碳源,因此土壤高有機碳含量可促進反硝化微生物的生長[45]。反硝化功能基因(nirS+nirK)/nosZ的豐度比值可反映反硝化過程N2O的排放情況。本研究中,玉米地土壤的(nirS+nirK)/nosZI比值在80—100 cm達到最大值(5.5),N2O排放潛勢高,但由于N2O向上遷移的過程中,可被表層反硝化微生物截留、轉化為N2。因此,推測深層土壤具有較高的反硝化潛力,可用于考慮篩選反硝化微生物的富集培養土壤,而如何平衡深層土壤反硝化微生物活性及硝酸鹽淋溶則是今后地下水污染的重要課題之一[46—47]。

4 結論

本文結果表明：不同土地利用方式下,土壤硝化和反硝化微生物在季節更替和土壤垂直方向上存在顯著差異,而不同氮轉化微生物對季節變化的相應則不同。玉米地春季農田土壤氨氧化、反硝化微生物豐度均顯著高于林地,氨氧化潛勢也均高于林地。土壤碳、氮含量,硝化、反硝化微生物豐度及亞硝酸鹽氧化潛勢隨土壤深度增加而顯著下降。可見,如何提高土壤保氮能力、防控硝態氮淋溶和N2O排放仍是今后農田氮肥管理和生態環境保護的研究重點。