miR-7-5p靶向抑制REGγ對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移及侵襲能力的調(diào)控作用

姚旭楓，蒲映宏，楊君毅，羅鑫榮，王小毅

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 400016)

乳腺癌目前已成為全球發(fā)病率及死亡率最高的女性惡性腫瘤，三陰性乳腺癌是其中一種類型，特征為腫瘤細(xì)胞不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因襲受體2，由于缺乏相對(duì)特異的治療措施，預(yù)后相對(duì)較差[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間及生活質(zhì)量[2]。因此，尋找能夠負(fù)向調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的靶向具有重要意義。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體激活因子3(REGγ)在乳腺癌中表達(dá)顯著上升，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，提示REGγ在乳腺癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用。因此，如何抑制REGγ的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用值得進(jìn)一步研究。微小RNA(microRNA)是一類高度保守的小分子RNA，能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)受到關(guān)注[4]。通過(guò)生物信息軟件查詢，REGγ為miR-7-5p下游潛在靶基因。多項(xiàng)研究[5-7]表明，miR-7-5p可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、FAK、KLF4等基因抑制腫瘤細(xì)胞的增生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移等。本課題組前期研究[8]還發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p能夠通過(guò)靶向調(diào)控REGγ的表達(dá)，進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，但是否參與調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲尚不明確。本研究以MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討miR-7-5p靶向抑制REGγ對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-231細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞資源中心)，1640培養(yǎng)液(Gibco公司，c11875500bt)，胎牛血清(Gibco公司，10099141c)，胰蛋白酶(Gibco公司，25200072)，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)系統(tǒng)(Promega公司，E1910)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(銳博公司，Lot2121)，miRNA qRT-PCR引物(銳博公司，MQPS0002204)，qRT-PCR試劑盒(Invitrogen，4385617)，Transwell小室(Millipore公司，MCMP24H48)，Matrigel膠(Millipore公司，E1270)，TRIzol(Invitrogen公司，15596026)，脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司，11668019)

1.2 方法

1.2.1 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)板底部80%～90%時(shí)，使用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化和傳代。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將細(xì)胞接種至6孔板并分為陰性對(duì)照組，REGγ敲減組，miR-7-5p過(guò)表達(dá)組，REGγ和miR-7-5p同時(shí)過(guò)表達(dá)組。一般為2×105/mL，當(dāng)細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)進(jìn)行RNA或蛋白提取。

1.2.2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) MDA-MB-231細(xì)胞接種在6孔板中，生長(zhǎng)至基本鋪滿6孔板，使用20 μL移液頭以相同的力度及角度在培養(yǎng)孔中央作一縱行劃痕，用PBS洗掉多余的細(xì)胞，并進(jìn)行拍照記錄，劃痕寬度記為L(zhǎng)0，24 h后進(jìn)行拍照，劃痕寬度記為L(zhǎng)1。按照公式(L0-L1)/L0計(jì)算劃痕愈合程度。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)需提前鋪Matrigel膠，遷移實(shí)驗(yàn)則不需要；將Matrigel膠與無(wú)血清1640培養(yǎng)液按照1∶8比例稀釋，每個(gè)小室加入50 μL，37 ℃至膠凝固；使用時(shí)鋪膠的小室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，然后輕輕吸出所有的液體；經(jīng)過(guò)處理的MDA-MB-231細(xì)胞，計(jì)數(shù)2×105/mL，用無(wú)血清1640重懸后接種100 μL在涂有Matrigel膠的Transwell上層小室內(nèi)，小室的下層加入600 μL含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)，24 h后，用磷酸鹽緩沖液漂洗小室3次，棉簽擦拭小室上層的細(xì)胞和Matrigel膠，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置，將膜洗凈晾干，固定于載玻片上，顯微鏡照相記數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)過(guò)處理的MDA-MB-231細(xì)胞，采用TRIzol法提取樣本的總RNA并ND2000測(cè)取濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用銳博miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。miR-7-5p以U6為內(nèi)參，REGγ以β-actin為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用課題組前期構(gòu)建的攜帶REGγ3端非編碼區(qū)質(zhì)粒，野生型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-WT和突變型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-Mut，在MDA-MB-231細(xì)胞中使用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染攜帶REGγ3端非編碼區(qū)質(zhì)粒、miR-7-5p或陰性對(duì)照，海腎熒光pRL-TK質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)檢測(cè)熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲減REGγ對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

采用課題組前期構(gòu)建的陰性對(duì)照細(xì)胞株及REGγ敲減細(xì)胞株，通過(guò)Transwell檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，REGγ敲減組的侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-7-5p可特異結(jié)合REGγ的3端非翻譯區(qū)

采用課題組前期構(gòu)建的野生型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-WT (REGγ3′UTR)和突變型pMIR-REPORT-REGγ-3′UTR-Mut (REGγ3′UTRm)質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢查熒光值，結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，與突變型質(zhì)粒相比，miR-7-5p可抑制野生型質(zhì)粒組的相對(duì)熒光值(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-7-5p對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，miR-7-5p過(guò)表達(dá)組劃痕愈合明顯減緩(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 共表達(dá)miR-7-5p和REGγ對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-7-5p相比，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-7-5p和REGγ可使侵襲細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)，但未超過(guò)陰性對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征，具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間及生活質(zhì)量[2]。三陰性乳腺癌是乳腺癌的其中一個(gè)亞型，占15%～20%，因缺乏相對(duì)特異的治療措施，治療效果欠佳[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p可通過(guò)靶向調(diào)控REGγ抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。為明確miR-7-5p在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲中的調(diào)控作用，本研究通過(guò)敲減REGγ，過(guò)表達(dá)miR-7-5p，同時(shí)過(guò)表達(dá)REGγ和miR-7-5p，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-7-5p可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，過(guò)表達(dá)REGγ可削弱miR-7-5p的抑癌作用，證實(shí)miR-7-5p可通過(guò)靶向調(diào)控REGγ的表達(dá)，從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，發(fā)揮抑癌作用。

REGγ又名PSME3，是一類通過(guò)水解下游目標(biāo)蛋白發(fā)揮癌基因角色的蛋白酶，具體機(jī)制不明確，可能是通過(guò)激活20s蛋白酶體或非泛素化依賴的途徑發(fā)揮蛋白降解功能[10-12]。課題組前期研究[3，13]顯示，REGγ在乳腺癌中表達(dá)上升，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲減REGγ的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示REGγ與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究顯示，無(wú)論是直接敲減REGγ，還是通過(guò)miR-7-5p的轉(zhuǎn)錄后抑制，均可達(dá)到抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力，提示靶向抑制REGγ可發(fā)揮抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的作用，但REGγ如何發(fā)揮抑制作用目前尚無(wú)明確的機(jī)制。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移于Wnt、JAK/STAT等信號(hào)通路異常活化關(guān)系密切，REGγ是否可能通過(guò)水解信號(hào)通路抑制因子發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用值得進(jìn)一步研究。

miRNA是一類高度保守的RNA，依靠調(diào)控下游基因的不同發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。研究顯示，miR-7-5p在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt、FAK和KLF4等下游靶標(biāo)發(fā)揮抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的特性[5-7]。但是，miRNA也表現(xiàn)出靶點(diǎn)不特異的缺點(diǎn)。本研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-7-5p可靶向結(jié)合REGγ的3斷非編碼區(qū)，從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲，但是這種抑制作用無(wú)法被過(guò)表達(dá)下游基因REGγ完全逆轉(zhuǎn)。miR-7-5p可靶向結(jié)合REGγ并抑制REGγ的表達(dá)，可以作為一個(gè)基因精準(zhǔn)調(diào)節(jié)的工具；另外，miR-7-5p還同時(shí)調(diào)控其它下游基因發(fā)揮抑癌作用。因此，miRNA是通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)發(fā)揮特定功能。

綜上所述，miR-7-5p通過(guò)靶向抑制REGγ的表達(dá)，通過(guò)負(fù)向調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。