花生AhMAPK 14基因的克隆及表達分析研究

朱立飛張初署唐月異陳 娜潘麗娟遲曉元張建成王 通王 冕

(山東省花生研究所/農業農村部花生生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省花生重點實驗室,山東 青島 266100)

植物在生長發育過程中會面臨多種脅迫,為了應對這些脅迫刺激,維持正常生命活動,植物經過長期進化形成了一套復雜的調控機制。其中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)級聯途徑是真核生物中普遍存在的一類較保守的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,在感知上游信號和響應逆境脅迫中起分子開關的作用,是植物體內重要的防御反應機制[1-3]。

MAPK通路一般由三種激酶組成,分別為MAP3K(MAPKKK)、MAP2K(MAPKK)和MAPK,這三種激酶形成MAPK級聯的基本模式MAPKKK-MKK-MAPK,其中MAPKKK磷酸化并激活MKK,激活的MKK磷酸化并激活MAPK[4]。MAPKs通常存在于細胞質和細胞核中,參與植物的細胞分裂、生長發育、激素信號傳遞、非生物脅迫與病原菌的防御等過程[5-7]。研究表明,在擬南芥中鹽脅迫可以激活MKK2-MAPK3/MAPK6正調控通路,也可以激活MKK9-MAPK3/6負調控通路[8-9];此外,水稻中的 Os MAPK4、Os MAPK7、Os MAPK14,玉米的Zm MAPK3,棉花的Gh MAPK2和Gh MAPK16等在應對干旱脅迫過程中發揮著重要作用[10-15]。同時,也有報道證實在擬南芥、煙草、玉米、棉花等植物中,MAPK級聯反應參與ABA、JA等多種激素的信號轉導[16-17]。MAPK級聯途徑響應逆境脅迫的分子機制已在多種作物中報道,但其在花生中的作用機制卻鮮有研究。

花生(ArachishypogaeaL.)是人類飲食中油脂和蛋白質的主要來源之一,在世界范圍內廣泛種植[18]。我國是世界上重要的花生生產大國和消費大國,也是花生貿易大國,花生產業在我國農業生產和社會生產中占據重要地位[19-20]。作為地上開花,地下結莢的植物,花生的生長發育很容易受到外界環境的影響[21]。近年來,由于氣候多變,干旱洪澇頻發,環境因素成為制約花生產業的重要影響因子。因此,如何提高花生在逆境脅迫下的適應能力已成為我們亟待解決的難題。目前國內外對花生脅迫的研究主要集中在花生病害相關數量性狀基因定位(quantitative trait locus,QTL)挖掘及分子標記的開發等[22]。有關花生在抗逆分子機理方面的研究還處于起步階段,與其他植物相比仍存在很大差距。

本研究以課題前期轉錄組測序結果為基礎,篩選并克隆獲得關鍵基因AhMAPK14并以此為研究對象,通過實時熒光定量PCR檢測其在花生各個組織中的表達量,以及在各種脅迫處理誘導下的表達量。初步證明其在花生中MAPK級聯途徑參與應對生物及非生物脅迫的過程。這將有助于我們更好地了解花生響應逆境脅迫的分子機理,為提高花生逆境適應能力提供重要依據,同時也為選育花生抗性新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供試品種為花育20號(ArachishypogaeaL.cultivar Huayu20),由山東省花生研究所育成并保存。

1.1.2 質粒與菌株

實驗所用菌種均為實驗室保存,PMD18-Tsimple、PMD19-T等克隆載體購于TaKaRa公司,載體pCAMBIA-1300于本實驗室保存。

1.1.3 實驗試劑

實驗所用試劑及試劑盒分別購自Promega、Sigma、TaKaRa、天根、上海生工等公司。所用RNase、抗生素和普通化學試劑均為國產分析純。

1.1.4 引 物

本研究取花育20號品種4葉期花生葉片提取RNA,反轉錄合成cDNA,作為基因克隆的模板,所用引物如表1所示。

表1 實驗所需引物Table 1 Primers required for the experiment

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及系統發育樹的構建

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站上傳測序結果,利用BLAST工具進行基因序列的同源性查找;利用DNAMAN軟件的Multiple Alignment對這些序列進行基因同源性比較,用 MEGA 7.0軟件的Neighbour-Joining法構建系統發育樹。

1.2.2 亞細胞定位

構建亞細胞定位載體35S::AhMAPK14-GFP,以35S::GFP為對照載體,通過農桿菌介導侵染3葉期本生煙葉片。培養2~5 d后取侵染葉片下表皮,于OLYMPUS FV300激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,日本)下觀察定位情況,OLYMPUS DP26數碼相機(奧林巴斯,日本)拍照。

1.2.3 組織表達模式分析

花生組織表達模式分析采用的材料為花生4葉期幼苗的根、莖、葉,盛花期的花生植株花瓣,成熟期的鮮花生種子的子葉以及取自催芽露白時花生種子胚的下胚軸。

1.2.4 誘導表達模式分析

花生實驗處理及取材方法參考自梁丹等花生MAPK13基因的克隆及表達分析研究[23]。

2 結果與分析

2.1 花生Ah MAPK 14基因的獲得

根據前期轉錄組測序已知序列設計引物(K14-F和K14-R),以花生cDNA為模板,進行PCR擴增,得到長約1 100 bp的片段(圖1-A)。之后利用編碼區序列設計引物,與已知的通用引物相結合,通過RACE-PCR技術,擴增得到5’非編碼區DNA片段和3’非編碼區DNA片段,兩端的片段約400 bp(圖1-B)。將上述3個片段與T載體連接、轉化DH5α,篩選轉化菌,PCR擴增得到1 800 bp左右的基因全長片段(圖1-C)。

圖1 花生Ah MAPK 14基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Ah MAPK 14 gene

2.2 Ah MAPK14的生物信息學分析

將克隆得到的基因序列與模式植物擬南芥作比對,發現與擬南芥中的AtMAPK14同源性較高,因此參照擬南芥將基因命名為AhMAPK14。花生全基因組測序后,通過BLAST工具檢索氨基酸序列發現,Ah MAPK14與Ah MAPK7(Arachis hypogaeaL:XP_025691811.1)同源性高達99.18%,由此猜測,AhMAPK14基因可能是AhMAPK7基因。此外,蛋白質分子序列進化樹結果顯示,花生Ah MAPK14與Ah MAPK7的親緣關系最近,并且Ah MAPK14與蔓花生Ad MAPK7的親緣關系較其他植物更近(圖2)。Ah MAPK14與許多物種的MAPK7蛋白序列同源性均在80%以上,說明Ah MAPK14在大多數物種中具有高度保守性。

圖2 Ah MAPK14蛋白質序列進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Ah MAPK14 protein sequences

選取親緣關系較近的幾個物種的MAPK7與Ah MAPK14進行氨基酸序列比對分析,發現MAPK14含有11個MAPK蛋白家族典型的保守區域,1個特異性的N端A-Loop保守基序和TEY基序(圖3)。MAPK家族的保守結構域是其參與植物防御反應的關鍵結構域,因此,我們推測Ah-MAPK14在花生抵御逆境脅迫過程中發揮作用。

圖3 Ah MAPK14多序列比對分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of Ah MAPK14

2.3 Ah MAPK14亞細胞定位

蛋白質的定位對其功能有重要影響。為進一步分析Ah MAPK14的功能,我們構建了Ah-MAPK14與GFP的融合載體35S::Ah-MAPK14-GFP,利用農桿菌介導轉化煙草后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光分布情況。結果顯示,Ah MAPK14定位于細胞核和細胞質中(圖4),與之前報道的MAPK家族成員的定位一致,進一步說明Ah MAPK14在花生中的作用可能與其他植物中MAPKs成員相類似。

圖4 Ah MAPK14亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of Ah MAPK14

2.4 Ah MAPK 14基因的組織表達模式分析

qRT-PCR檢測結果顯示,以子葉中的表達量為參照,AhMAPK14基因在花生的下胚軸和花中的相對表達量極高,在根、莖、葉中幾乎不表達(圖5)。AhMAPK14基因的表達具有一定的組織特異性,推測Ah MAPK14可能參與花生的胚軸發育和開花過程。

圖5 Ah MAPK 14基因在花生不同組織中的表達量Fig.5 Expression of Ah MAPK 14 in different tissues of peanut

2.5 AhMAPK 14基因響應植物激素和信號分子誘導

MAPKs參與植物激素信號途徑已在多種植物中被報道。我們用不同濃度的激素對花生幼苗進行處理,通過檢測發現,當受到ABA刺激后,AhMAPK14基因的表達量隨著時間推移呈逐漸上升,說明ABA處理能誘導AhMAPK14的表達;用乙烯處理后,AhMAPK14的表達量在短時間內明顯下降,之后逐漸回升;用GA處理后,AhMAPK14表達量的變化趨勢與用乙烯處理時相類似,說明乙烯和GA會抑制AhMAPK14的表達;SA處理后,AhMAPK14的表達量在短時間內沒有明顯變化,待48 h后才明顯升高;在受到JA和H2O2的刺激后,AhMAPK14的表達量顯著升高,并且上調倍數能達到10倍以上,這一結果表明JA和H2O2處理對AhMAPK14的表達影響較大。

圖6 不同植物激素和信號分子誘導Ah MAPK 14的表達分析Fig.6 Expression analysis on Ah MAPK 14 induced by different plant hormones and signal molecules

綜上所述,AhMAPK14能響應多種植物激素信號,且大多數植物激素能上調AhMAPK14的表達,僅有少數會起到抑制作用。同時,這些結果也表明MAPKs在花生中也能參與植物激素和信號分子傳導途徑。

2.6 非生物脅迫誘導Ah MAPK 14基因的表達

對花生幼苗分別進行低溫、干旱及鹽脅迫處理時,AhMAPK14的表達量均出現不同程度的上調。其中低溫處理時,AhMAPK14的響應比較緩慢;干旱處理時,隨時間推移,AhMAPK14的表達量呈先下降后上升之后逐漸降低的趨勢;NaCl處理時,AhMAPK14的表達量在短時間內上升較為顯著。以上表明,在花生中MAPK14的表達受干旱、低溫以及鹽脅迫的影響,且該影響可能具有時間上的特異性。因此,我們推測AhMAPK14基因參與花生抵御非生物脅迫的過程。

圖7 Ah MAPK 14基因在非生物脅迫下的表達分析Fig.7 Expression analysis on Ah MAPK 14 under abiotic stresses

3 討論與結論

目前已經從植物中成功分離到了很多MAPK,例如擬南芥、棉花、水稻、楊樹、玉米中分別有20、28、17、21、21個 MAPK[24-28]。 有研究表明,在擬南芥中已經克隆得到的20個MAPK家族基因被證明參與到植物生長的各個方面。擬南芥作為一種典型的模式植物,其基因組已實現全序列分析。本研究將克隆得到的基因與擬南芥進行序列比對,發現其與擬南芥中的At MAPK14同源性最高,因此將其命名為AhMAPK14。隨著花生基因功能注釋的逐漸完善,我們通過BLAST工具檢索發現,MAPK14蛋白與栽培種花生中MAPK7蛋白同源性極高,與野生型及蔓花生(花生祖先A.duranensis)中MAPK7的同源性也高達90%以上,與其他植物中的MAPK7蛋白同源性也非常高。由于花生種質資源較多,品種之間存在一定的差異性,因此我們猜測AhMAPK14基因就是花生中的AhMAPK7基因。

MAPKs存在于細胞質和細胞核中,參與不同的細胞生理過程,包括生長、發育和應激反應等[29]。本研究通過亞細胞定位發現Ah MAPK14定位于細胞質和細胞核中,這一結果也表明在花生中Ah MAPK14與其他MAPK家族成員發揮的功能可能具有相似性。此外,我們通過分析其組織表達模式發現AhMAPK14主要在花和下胚軸中表達,說明其可能主要在花和下胚軸中發揮作用,是否參與下胚軸的發育以及開花過程還有待進一步實驗研究。

在植物中,MAPKs在環境信號和發育信號的轉導中起著重要作用。通過調節MAPK級聯反應,細胞能夠對由高低溫、紫外線輻射、臭氧、活性氧、干旱、高低滲透壓、重金屬、傷害和病原體感染等引起的一系列脅迫作出反應[30-31]。此外,生長素(AUX)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、乙烯(ET)、油菜素內酯(BR)和赤霉素(GA)等激素也能通過MAPK級聯作用影響信號傳導[32-33]。我們通過實驗發現干旱、低溫、高鹽脅迫以及ABA、JA、SA、H2O2等激素或信號分子能誘導AhMAPK14的表達,與其他植物中的MAPKs表現相一致,表明MAPKs可能在不同物種之間具有相同的功能。之前有研究發現,在大白菜中,BraMAPK17-2和BraMAPK19-1的表達被GA3上調,而像BraMAPK3、BraMAPK10-2/3、BraMAPK10-4/5、BraMAPK5、BraMAPK13、BraMAPK1、BraMAPK7-1、BraMAPK7-2、Bra-MAPK8-1和BraMAPK16-2等多數BraMAPKs的表達量在GA3處理后顯著降低[34]。我們的實驗結果顯示GA及ET抑制AhMAPK14的表達,其響應GA的作用機理可能與白菜中有相似之處。MAPKs響應信號分子的作用機制是復雜的,關于Ah MAPK14參與花生信號通路的證據還需要進一步的實驗研究。

我們通過生物信息學分析、亞細胞定位、組織特異性表達分析、激素誘導表達分析等實驗證明,Ah MAPK14具有MAPK家族的共有特征,并且AhMAPK14基因的表達水平受非生物脅迫和多數植物激素的誘導,初步表明Ah MAPK14在花生中參與逆境脅迫過程與植物激素和信號分子傳導途徑。MAPKs參與花生中信號傳導和抵御非生物脅迫過程的具體作用機制尚不明確。下一步研究將繼續以Ah MAPK14作為切入點,詳細解析Ah MAPK14在花生防御非生物脅迫過程中的作用機制,為選育花生抗性品種提供新思路。