中國漢族人群SNPH 基因多態性與精神分裂癥的關聯研究

巫 珺 陸佳晶 黃欣欣 黃茹燕 呂欽諭，△ 易正輝，

（1上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心精神科 上海 200030；2復旦大學附屬華山醫院精神科 上海 200040；3上海市虹口區精神衛生中心精神科 上海 200083）

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一種復雜的精神疾病，據估計全球有2 100 萬人患有SZ，給社會與個體帶來了極大的負擔［1］。SZ 臨床癥狀復雜，以陽性癥狀、陰性癥狀、認知功能損害作為主要核心癥狀，并伴隨有情感障礙、意志行為障礙等其他臨床表現［2-3］。目前認為SZ 起病受到遺傳、生物和環境因素的交互影響。其中SZ 的神經遞質失調假說是目前最為重要的假說。而神經遞質的失調涉及多種蛋白質的協調和動態的相互作用。其中，可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）蛋白的復合物起著核心作用［4-5］。SNARE 復合蛋白或其調節因子的變化能夠影響囊泡的募集、對接、膜融合和再循環［6］，進而影響SZ 患者關鍵腦區不同神經遞質的突觸后信號轉導［7］，影響神經遞質的釋放，最終參與SZ 的發生［8-9］。

伸展蛋白（syntaphilin，SNPH）是SNARE 蛋白的重要調節因子。SNPH 蛋白在大腦特異性表達，特別是影響突觸可塑性的區域表達豐富。其表達啟動于嗜鉻細胞分裂細胞系（pheochromocytomaderived cell line，PC12）細胞的神經元分化的誘導，并分化為兩個細胞亞群，分別以線粒體外膜和突觸質膜為靶點［10］。已知SNARE 復合蛋白是由突觸融合蛋白-1、突觸小泡蛋白以及突觸相關蛋白 25（synaptosomal associated protein 25，SNAP-25）相互作用而形成。SNPH 蛋白能夠在膜融合階段與SNAP-25 競爭性結合游離的突觸融合蛋白-1，來抑制SNARE 復合體的形成。體外實驗顯示，對于培養基中的海馬神經元，SNPH 蛋白的瞬時過表達顯著減少了神經遞質的釋放，而將SNPH 蛋白引入突觸前頸上神經節的神經元則可抑制突觸傳遞?？傊琒NPH 蛋白能夠作為一個分子鉗，抑制SNARE復合體的裝配，來調節突觸囊泡的胞排作用［11］。并且蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化可以作為SNPH 蛋白的“關閉”開關，通過環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）依賴的信號轉導途徑阻斷其與突觸融合蛋白-1 的結合，抑制SNPH 蛋白的功能，說明SNPH的調節功能具有動態平衡［12］。并且，SNPH 蛋白也與神經退行性變存在關聯［13］。也有證據顯示，SZ 患者血漿神經源外泌體提取液中線粒體的SNPH 蛋白顯著高于健康對照組［14］，提示SNPH 蛋白參與SZ 發生的途徑具有多樣性。

SNARE 復合體與多種精神疾病的發生存在關聯，除SZ 外尚包括雙相情感障礙、注意缺陷多動障礙等［15-16］。因此，作為SNARE 復合體的重要抑制因子，SNPH基因可作為SZ 的候選基因。目前尚無SNPH基因多態性是否與SZ 存在關聯的相關報道。因此本研究假設SNPH基因多態性與SZ 發生存在關 聯。 我 們 選 取SNPH基 因 的 5 個 位 點（rs3764714、 rs3795139、 rs3803947、 rs3803949、rs6134520）進行多態性檢測，通過病例對照的關聯分析來探討SNPH基因多態性與中國漢族人群SZ發生的關聯性，以進一步明確SNPH基因與SZ 多態性的關系。

資料和方法

病例組本研究共納入SZ 患者389 例，來源于2015 年9 月至2018 年9 月在上海交通大學醫院院附屬精神衛生中心住院或門診患者。入組標準：（1）符合《國際疾病分類》第10 版（ICD-10）SZ 的診斷標準；（2）年齡小于65 歲；（3）漢族人群；（4）患者本人及其監護人簽署知情同意書。排除標準：（1）目前或既往符合ICD-10 中除SZ 以外的其他精神疾病患者；（2）具有明顯的自殺、自殘及危害他人傾向的患者；（3）有嚴重軀體疾病的患者；（4）存在物質及藥物濫用者。

對照組本研究共納入正常對照433 例，來源于廣告招募的社區志愿者。入組標準：（1）年齡小于65 歲；（2）漢族；（3）簽署知情同意書；（4）健康者與患者無血緣關系。排除標準：（1）有精神疾病及精神疾病家族史；（2）有嚴重軀體疾病史；（3）孕婦和哺乳期婦女。

本研究獲上海市精神衛生中心倫理審查委員會批準（批件號：2017-19R）。

SNP 位點的選擇SNPH基因數據從千人基因組 數 據 庫（http：//grch37.ensembl.org/index.html）中查到并下載，使用HaploView 軟件以及SNP 在線網 站（http：//gvs.gs.washington.edu/GVS150/）篩選 標 簽SNP（tag SNPs），針 對SNPH基 因（NC_000020.11，chr1：1266292～1309327）及 基 因 上 游2 000 bp，以連鎖不平衡系數（r2）＞0.8，微小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 的原則進行挑選，共挑選出5 個標簽SNPs，即rs3764714［chr20：1306461（GRCh38.p12）］，rs3795139［chr20：1305289（GRCh38.p12）］，rs3803947［chr20：1308322（GRCh38. p12）］ ，rs3803949 ［chr20：1308693（GRCh38. p12）］ ，rs6134520 ［chr20：1307579（GRCh38.p12）］。其中rs3795139 位于外顯子區域。rs3764714、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位于3’端UTR 區。

由于不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的頻率出現。在某一群體中，不同座位某兩個等位基因出現在同一條染色體上的頻率高于預期的隨機頻率的現象，稱為連鎖不平衡。應用HaploView 4.2 軟 件 對SNPH基 因5 個SNP 位 點 進行連鎖不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），單倍型頻率＜3.0%將不被納入后續分析。以D’值來衡量各位點之間的連鎖不平衡程度，建議D’＞0.8可以構成一個單倍型區塊。分析結果顯示：SNPH基因的rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 5 個SNP 位點可以構成一個單倍型區塊（圖1）。

圖1 5 個SNPs 的連鎖不平衡分析結果Fig 1 Results of linkage disequilibrium analysis of 5 SNPs loci

DNA 提取抽取病例組及對照組人群外周靜脈血5 mL，置于EDTA 抗凝管中抗凝，采用血液基因組DNA 提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取全血DNA 后，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

基因型檢測應用TaqMan 熒光探針基因分型技術對rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點的SNP 進行檢測。TaqMan SNP Genotyping Assays 試 劑 盒 、TaqMan SNP Genotyping Mix 試劑盒及PCR 擴充應用7900 HT熒光實時定量PCR 儀購自美國ABI 公司。PCR 擴增反應體系為5 μL，包括2×Taqman Master Mix 試劑2.0 μL，40×Taqman Genotyping Assay 試 劑0.05 μL，DNA（15～20 ng/μL）2 μL，H2O 0.95 μL。PCR 反 應 條 件：95 ℃10 min 預 變 性；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共進行50 個循環，每例樣本均重復檢測3 次。 采 用 SDS version 2.1 軟 件 中 Allelic Discrimination 程序進行基因分型，通過檢測不同等位基因FAM 和VIC 熒光強度來判斷樣本的基因型，并將結果保存。

統計學方法選擇位點前，使用SPSS 26.0 對病例組和對照組一般人口統計學資料進行比較，其中計數資料采用χ2檢驗，計量資料應用獨立樣本t檢驗。并使用Haploview 統計軟件進行兩兩位點之間的LD，用D’值來度量各個位點間的連鎖不平衡程度。選擇位點后，應用在線SHEsis 軟件（http：//analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm）進行單個位點的關聯分析（等位基因、基因型頻率的比較）及位點之間的單倍型分析，通過計算比值比（odds ratio，OR）與95%CI 以了解等位基因和疾病的關聯強度（OR＞1 是危險因素；OR＜1 是保護因素），并對各組間基因型頻率分布進行H-W 平衡吻合度檢驗。采用SNPstats（https：//www.snpstats.net/snpstats/start.htm）在線軟件對不同位點的遺傳模式進行分析。關聯分析結果采用Bonferroni進行校正檢驗，即每個SNP 的P值乘以所分析的遺傳標記數目，以校正后的P＜0.05表示位點與疾病之間的關聯有顯著性。

應用Quanto 1.2.4 軟件進行計算樣本的統計效能，5 個SNP 中rs3764714 的微小等位基因頻率（MAF=0.056）最小。假設OR=1.5，加性模式為參考，疾病一般人群患病率為1%，病例組389 例，對照組433 例，計算結果顯示：統計效能為0.99。

其中，在線Shesis 軟件主要具備3 種分析功能，首先可以進行單位點分析，以進行等位基因頻率和基因型頻率統計為主，其次可對位點進行兩兩D’和r2的計算，最后可以對單倍型進行分析。 而SNPstats 是一個從遺傳流行病學的角度設計的網絡應用程序，能夠進行關聯分析。Quanto 1.2.4 軟件是一個計算效能或所需樣本大小的程序，用于基因、環境因素、基因-環境（G×E）相互作用或基因-基因（G×G）相互作用的關聯研究。使用各個軟件時均按照軟件要求進行數據編碼。

結 果

一般人口學資料病例組共389 例，其中男性208 例（53.5%），女性181 例（46.5%）；年齡13～65歲，平均（36.74±18.27）歲。正常對照組共入組433例，其中男性224 例（51.7%），女性209 例（48.3%）；年齡17～64 歲，平均（36.22±13.00）歲。病例組與對照組性別（χ2=0.329，P=0.566）和年齡（t=0.473，P=0.636）差異均無統計學意義。

Hardy-Weinberg 平衡檢驗5 個位點（rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）在病例組和對照組中均符合H-W 平衡（P＞0.05），可以被納入后續的分析。

SNPH基因5 個位點等位基因和基因型分布的比較結果表明，病例組（SZ 組）與對照組（HC 組）中 5 個 SNP （rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）等位基因及基因型分布差異無統計學意義（表1）。

表1 病例組與對照組等位基因和基因型比較Tab 1 Comparison of allele frequencies and genotype frequencies of case group and control group

不同遺傳模式下基因型分布比較在共顯性、隱性、顯性及加性遺傳模式下，病例組與對照組rs3764714、 rs3795139、 rs3803947、 rs3803949、rs6134520 基因型分布差異均無統計學意義（表2，其中加性模式為參考）。

表2 病例組與對照組不同遺傳模式下基因型的比較Tab 2 Comparison of genotype distribution in different models between case group and control group

病例組與對照組的單倍型分析應用SHEsis 在線軟件對病例組（SZ 組）及對照組（HC 組）間單倍型進行 分 析，發 現 由rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點組成的單倍型A-A-A-C-T，G-A-G-T-T，G-G-G-C-C頻率＞3%，后續分析發現3個單倍型在兩組間的分布差異無統計學意義（表3）。

表3 病例組與對照組單倍型分布的比較（rs3764714，rs3795139，rs3803947，rs3803949，rs6134520）Tab 3 Comparison of Haplotype distribution of case group and control group（rs3764714，rs3795139，rs3803947，rs3803949，rs6134520）

討 論

SZ 的神經遞質假說是目前用以解釋SZ 發病原因的主流觀點，而SNARE 復合體對神經遞質的釋放過程起著關鍵作用，并最終影響SZ 的發生發展。因此，作為SNARE 復合體組裝的抑制因子，SNPH蛋白同樣在神經遞質傳遞過程中扮演著重要的角色，SNPH基因可作為SZ 遺傳學研究的候選基因之一而受到關注。

在本研究中，5 個位點在病例組和對照組中均符合H-W 平衡，可以進行下一步分析。而病例組和對照組在年齡與性別方面差異均無統計學差異，數據較為匹配。根據統計效能檢驗，本研究統計效能為0.99，統計效能較好。研究結果發現，在中國漢族人群SZ 患者和健康人群之間，SNPH基因5 個SNP位 點（rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520）等位基因及基因型頻率分布差異均無統計學意義。在共顯性、隱性及加性遺傳模式下，兩組之間5 個SNP 位點基因型頻率分布差異均無統計學意義。這表明該基因的多態性可能與SZ 的發生沒有關聯，其特定的等位基因或者基因型可能不會導致SZ 的發病風險增加。針對SNPH基因5 個SNP 位點進行的連鎖不平衡分析顯示，該5 個位點可構成一個單倍型區塊（D’＞0.8）。然而，在單倍型 分 析 中，由rs3764714、rs3795139、rs3803947、rs3803949、rs6134520 位點組成的單倍型A-A-A-CT、G-A-G-T-T和G-G-G-C-C頻率分布在病例組與對照組間差異無統計學意義（P=0.978、0.535、0.524），說明這3 種單倍型可能不會增加SZ 的發病風險。本研究結果顯示，在中國漢族人群中SNPH基因可能不是SZ 發生的易感基因。

本研究選取的SNPH5 個SNP 位點在SZ 相關研究中均未見報道，但有研究顯示，SNPH 蛋白與多種神經系統疾病相關。首先，SNPH 蛋白可能與腦白 質 病 變（white matter lesions，WMLs）有 關［17］。WMLs 是一種伴有脫髓鞘和認知功能下降的腦血管疾病。其次，體外實驗證實，樹突中SNPH過度表達會誘導N-甲基-D-天冬氨酸興奮毒性、減少線粒體鈣攝取和阻止線粒體自噬，導致線粒體功能的損害，最終與神經退行性疾病多發性硬化（multiple sclerosis，MS）相關［18］?？梢奡NPH 蛋白在大腦的結構與功能中具有一定的調節作用。但是對于同樣伴隨有認知功能下降的SZ，SNPH 蛋白作為其神經遞質假說中的重要中介因素，相關的研究卻極少，因此本研究具有一定的創新性和開拓性。

本研究在以下幾個方面具有局限性。首先，所選5 個點屬于一個區塊，進行基因型分析時可能由于LD 的存在而造成混雜。候選基因法選點時應考慮編碼SNPs（cSNPs），即在基因上首先考慮CDS區域（外顯子）及啟動子等，本研究選點時在編碼SNPs（cSNPs）上考慮不足。多個位點位于3′UTR區，且僅1 個SNP 在外顯子上，本研究對功能SNPs的探究不足。雖然3′-UTR 區可能在生物復雜性的調節中發揮重要作用，但更多3′-UTR 區的SNPs 高度保守，編碼區的SNPs 功能普遍更為重要。其次，僅選取了SNPH基因的5 個SNP 位點進行關聯分析，即使這5 個位點是經過篩選得到的，也不足以反映SNPH基因的全部信息，在后續研究中需擴大進行關聯分析的SNP 位點規模，以進一步探索SNPH基因的相關信息。此外，本研究僅僅初步探討了SNPH基因多態性與SZ 的相關性，該基因多態性與SZ 相關受體、遞質、蛋白的關聯，以及其他基因與SNPH之間的相互作用需要進一步研究，以明確SNPH基因多態性在SZ 發生機制中的作用。進一步驗證SNPH基因多態性與SZ 的關聯需要設計更加嚴謹的實驗方案，增加樣本量，保證入組患者的同質性，進行重復性實驗。

作者貢獻聲明巫珺 論文構思、撰寫和修訂，病例收集，數據采集，基因分型。陸佳晶 數據統計和分析，論文撰寫。黃欣欣，黃茹燕 病例收集，數據統計和分析。呂欽諭，易正輝 數據分析，論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。