錦鯉雌核發(fā)育繁殖技術(shù)

酈森慶，劉 峰，俞國鈞，阮秋梅，姚金榮

(1.紹興市上虞區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江 紹興 312300；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310000；3.紹興御錦生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江 紹興 312300)

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展、人們生活水平的提高，消費者對具有觀賞性和美好寓意的錦鯉需求量不斷增加。然而，錦鯉在養(yǎng)殖過程中需要不斷地篩選才能獲得具有高觀賞價值的錦鯉成品，最終的養(yǎng)殖成品率往往較低。養(yǎng)殖企業(yè)迫切需要通過技術(shù)手段生產(chǎn)具有高觀賞價值的錦鯉品系，以提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，雌性錦鯉較雄性錦鯉具有更寬的背部和更豐滿的體形，具有更高的觀賞價值。為此，2021 年紹興市上虞區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣中心與浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所合作，在紹興御錦生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司開展了錦鯉全雌品系生產(chǎn)試驗，初步獲得成功，共獲得雌核發(fā)育后代魚苗1 000尾，為錦鯉全雌繁殖奠定了種質(zhì)資源基礎(chǔ)。現(xiàn)將有關(guān)情況總結(jié)如下。

一、親魚選擇

1.錦鯉親魚選擇和培育 試驗選留了品系純正優(yōu)良、特征明顯、身體健壯靈活、游姿優(yōu)美、全身光潔無病害的紅白、大正、昭和3 個品系魚196尾作為親魚，包括雌魚56尾、雄魚140尾(5～7 齡)，暫養(yǎng)于親魚培育池。繁殖前45 天在常規(guī)投喂配合飼料的同時增加投喂面包蟲，進行營養(yǎng)強化；1個月后停喂面包蟲，同時將人工配合飼料減半，控制投飼，以促進性腺發(fā)育和保持較好的肥滿度。5 月24 日從日本進口親魚20 尾，暫養(yǎng)于圓形帆布桶中，作為后備親魚。

2. 團頭魴雄魚收集和暫養(yǎng) 團頭魴雄魚60 尾，規(guī)格2.0～2.5 千克/尾。5 月5 日購自松江區(qū)水產(chǎn)良種場，用活水車運至紹興御錦生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)人工配制的3%鹽水浸泡消毒后，暫養(yǎng)于室內(nèi)3米3的塑料桶中備用。

二、人工催產(chǎn)

1.催產(chǎn)劑種類

促黃體素釋放激素類似物(LRH-A2)、多情素(HCG)、地歐酮(DOM)配合使用。

2.催產(chǎn)劑量

錦鯉雌魚劑量為HCG 800單位/千克＋DOM 2毫克/千克＋LRH-A25微克/千克，錦鯉雄魚減半。團頭魴雄魚劑量為HCG 400 單位/千克＋DOM 1 毫克/千克＋LRH-A22.5微克/千克。

3.注射方法

采用胸鰭基部注射法，催產(chǎn)劑現(xiàn)配現(xiàn)用，待催產(chǎn)親魚經(jīng)稱重后分批催產(chǎn)，錦鯉和團頭魴催產(chǎn)同步進行。產(chǎn)卵池配備凈水設(shè)備和增氧設(shè)備，并預(yù)先放置了消毒過的配套網(wǎng)箱，內(nèi)置塑制毛刷和薄膜作產(chǎn)卵魚巢，待產(chǎn)過程中始終充氣增氧且循環(huán)流水。經(jīng)檢查，錦鯉雄魚和團頭魴雄魚精液質(zhì)量好。

三、精液收集與精子滅活

根據(jù)親魚催產(chǎn)效應(yīng)時間，觀察到錦鯉親魚發(fā)情、自然交配產(chǎn)卵開始時，及時收取團頭魴精液，以備后用。精液收取方法：一人用濕毛巾包裹團頭魴魚體并固定，將魚的腹部朝上平放，另一人用柔軟干凈的毛巾擦干魚腹，輕按腹部，白色精液隨之流出，用吸管或針管吸取精液放入貯精瓶，再放入冰箱冷藏保存待用。精子采用紫外滅活儀進行滅活。

四、卵子采集

錦鯉親魚成熟度較好，催產(chǎn)后效應(yīng)時間在12 小時左右，隨時觀察。當(dāng)發(fā)現(xiàn)魚開始追尾、卵巢及網(wǎng)箱上附有少量卵時，及時撈出雌魚進行人工擠卵。方法是：用魚夾固定雌魚，一手指堵住泄殖孔，再用柔軟干凈的毛巾擦干魚腹；雌魚的腹部朝下呈45 度角，放開手指，輕輕擠壓腹部，讓卵子自動落入事先準(zhǔn)備好的干凈玻璃皿中，避光于冰箱低溫保存，待誘導(dǎo)雌核發(fā)育。5 月6 日開始至6月18日結(jié)束，試驗共采集卵子6批次。

五、冷休克誘導(dǎo)雌核發(fā)育

1.誘導(dǎo)染色體加倍

將滅活的團頭魴精子加入錦鯉卵子中，用鵝毛沿同一方向攪拌均勻，混合后的卵子均勻撒在水中魚巢上，上巢、激活連續(xù)進行。撒卵過程中注意布卵密度，不要重疊。靜置2分鐘，待卵子粘牢后將卵巢移入溫度控制儀進行冷休克處理。誘導(dǎo)雌核發(fā)育后的卵子放入露天的帆布孵化桶中孵化。

2.各項參數(shù)優(yōu)化試驗

基于錦鯉雌核發(fā)育首次試驗，借鑒了其他魚類雌核發(fā)育的冷休克方法，選擇了不同檔的冷休克溫度和處理時間等參數(shù)，以所得雌核發(fā)育魚苗量為標(biāo)準(zhǔn)，比較不同冷休克參數(shù)的試驗效果。

六、試驗結(jié)果

1.雌核誘導(dǎo)發(fā)育

試驗共獲得雌核發(fā)育后代魚苗1 000 尾，雌核誘導(dǎo)孵化率平均為0.067%。

2.冷休克方案篩選

試驗結(jié)果顯示，3℃冷休克處理獲得雌核發(fā)育魚苗數(shù)量稍少于4℃處理結(jié)果，兩者顯著多于5℃處理結(jié)果。試驗結(jié)果表明，最佳冷休克實施方案為精子滅活時間14～17 分鐘，受精2～2.5 分鐘，冷休克溫度4℃，冷休克處理時間20～25分鐘。

3.群體遺傳多樣性檢測

試驗結(jié)果表明，平均觀測雜合度(Ho)為0.516，平均期望雜合度(He)為0.582，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.541(＞0.5)。從多態(tài)位和平均雜合度等遺傳參數(shù)的數(shù)值來看，該群體在36 個微衛(wèi)星位點的觀測雜合度水平均較高，說明養(yǎng)殖的日本錦鯉具有很高的遺傳多樣性，這跟每年補充新的種質(zhì)資源密切相關(guān)，有效避免了累代近交導(dǎo)致的種質(zhì)衰退。

4.雌核發(fā)育苗種倍性檢測

雌核發(fā)育錦鯉DNA 平均含量與錦鯉DNA 平均含量的比值為0.98，與團頭魴DNA平均含量的比值為1.43，由此得出，雌核發(fā)育錦鯉的倍性與母本錦鯉保持一致。

七、分析與討論

1.人工雌核發(fā)育能快速產(chǎn)生近交系

經(jīng)過一代人工雌核發(fā)育，子代近交系數(shù)平均約可達到0.6，相當(dāng)于連續(xù)4 代近交。人工雌核發(fā)育結(jié)合性別人工控制后，理論上可在兩個世代時間內(nèi)獲得所有基因座位完全純合的純系，純系親本可以穩(wěn)定雜種優(yōu)勢。對于一些具有較快生長速度及較高商業(yè)價值的雌性種類，則可通過人工雌核發(fā)育與人工性別控制相結(jié)合的方法，大量繁殖全雌型后代。對于生產(chǎn)更具觀賞性和經(jīng)濟價值的雌性錦鯉而言，雌核發(fā)育技術(shù)具有很大的優(yōu)越性和較高的實際應(yīng)用價值。

2.雌核發(fā)育卵孵化率較低的原因

本試驗雌核誘導(dǎo)孵化率較低，對于養(yǎng)殖生產(chǎn)要求并不理想。究其原因，筆者認(rèn)為：一是冷刺激設(shè)備與生產(chǎn)量不匹配。項目組是第一次進行生產(chǎn)性錦鯉雌核發(fā)育技術(shù)研究，應(yīng)用了實驗室的冷刺激設(shè)備，其容積較小，冷刺激溫度較難控制，影響了雌核誘導(dǎo)發(fā)育。二是雌核發(fā)育卵在露天孵化，沒有控制好孵化水溫，孵化時間較長，發(fā)生了水霉病，導(dǎo)致卵子大量死亡，其中二批次卵全部死亡。因此，在今后的研究中，項目組將積極創(chuàng)造條件，優(yōu)化技術(shù)，努力提高雌核誘導(dǎo)孵化率。

錦鯉的全雌品系生產(chǎn)技術(shù)包括雌核發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)和偽雄誘導(dǎo)技術(shù)。制備錦鯉的雌核發(fā)育系是基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上培育偽雄系。偽雄系與雌性錦鯉交配，完成錦鯉全雌品系生產(chǎn)，以實現(xiàn)高附加值錦鯉全雌養(yǎng)殖。