蒲公英多糖提取及其抗氧化活性研究

舒玉鳳 盧靜靜 陳 旭

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北武漢 430205）

蒲公英（Taraxacum mongolicum）味微苦、寒性，具有清熱解毒和利尿等療效[1]。蒲公英含有黃酮、植物甾醇、多糖、三萜類、膽堿等活性物質，具有消除炎癥、增強機體免疫力、抵御病毒和防御腫瘤等藥理作用[2-4]，是一種藥食同源植物[5]，可以用于食品、方劑、保健品和護膚品中。多糖作為蒲公英的活性成分之一，具有提高免疫力、降低血脂、預防衰老和抗輻射等功能，其在醫療和保健方面具有重要的潛在應用價值[6-7]。國內外普遍使用酶解法和熱水浸提法提取蒲公英中的多糖[8-9]。熱水浸提法受多糖種類的影響較小，且能在保證安全生產的同時統籌降低成本、提高效率，因而較酶解法提取應用范圍更廣。

自由基又稱游離基，是一種能夠破壞細胞的化學物質。其可以破壞機體內的遺傳基因組織、酶、脂肪、碳水化合物等，從而導致食品腐敗變質。目前主要通過添加防腐劑和抗氧化劑，抑制食品中有害微生物生長，減緩食品氧化變質過程。但是，工業合成的抗氧化物存在較多的安全隱患。從食物和天然產物中尋找活性物質，并將其開發成為具有抑菌、抗氧化、降血糖、降血脂及降血壓等功效的功能性食品或藥物成為研究熱點[10]。據文獻[11]報道，天然活性成分可提供氫離子或螯合金屬離子，達到清除自由基的目的。因此，研究植物及中藥提取物對抑制自由基的產生具有重要意義。

本研究采用熱水浸提法提取蒲公英多糖，探究影響蒲公英多糖得率的因素，并對此進行優化，確定最佳提取條件，同時研究蒲公英多糖抗氧化活性，以期為進一步開發利用蒲公英多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗材料。試驗材料：蒲公英，購自當地中藥店；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、DPPH、H2O2和鄰苯三酚，均為國產分析純；試驗用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器與設備。試驗儀器有紫外分光光度計（UV-1800 CP，上海美譜達儀器有限公司）、高速萬能粉碎機（FW-200，北京中興偉業儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（HH-S4，金壇市富華儀器有限公司）、電熱鼓風干燥箱[DHG-9240（A），上海精宏實驗設備有限公司]、離心機（TDL-5-A，上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理。選取無蟲蛀、無霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎機中粉碎，過60目篩，將蒲公英粉末采用索氏抽提法在50℃條件下用石油醚回流處理4 h后得到脫脂蒲公英粉末，過篩、干燥，備用。

1.2.2 蒲公英多糖提取工藝。稱取適量脫脂蒲公英粉末，加入去離子水攪拌均勻，熱水浸提后取出，放置于室溫下冷卻。在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇，密封之后在4℃條件下靜置24 h，再次在4 000 r/min條件下離心20 min，數次清洗沉淀，將沉淀用去離子水溶解并定容至100 mL，在490 nm處測吸光度。通過標準曲線計算多糖含量[12]，并按照如下公式計算蒲公英多糖得率：

式中：m1代表多糖質量；m2代表樣品質量。

1.2.3 單因素試驗。以蒲公英粉末為原料，利用熱水浸提法，研究提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時間（60、90、120、150、180 min）和 液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]對蒲公英多糖得率的影響。

1.2.4 響應面試驗。在單因素試驗條件下，將Box-Behnken試驗作為依據設計試驗原理，以蒲公英多糖得率作為響應值，進行響應面試驗，并驗證最佳工藝條件。試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面因素分析水平

1.2.5 抗氧化活性測定。①DPPH自由基清除能力的測定。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液和0.1 mmol/L DPPH溶液2.0 mL混合，充分搖勻[13-14]，在避光條件下反應30 min，以無水乙醇作為空白，在510 nm波長處測吸光度。以VC作為對照品，3次重復，取平均值。②羥基自由基清除能力的測定。分別取不同濃度樣品溶液1.0 mL，加入 1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴400 min，然后在510 nm處測定吸光度。以相同濃度的VC作為對照，以同體積蒸餾水作為空白組，3次重復，取平均值。③超氧陰離子自由基清除能力的測定。分別取不同濃度的樣液2.0 mL，然后加入2.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值=8.8）。在室溫下混勻后加入0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚溶液后開始計時5 min，每隔30 s記錄在320 nm波長處的吸光度。以相同濃度的VC作為對照，以同體積的蒸餾水作為空白組，3次重復，取平均值。

1.3 數據統計分析

所有試驗均平行3次，取平均值。單因素及抗氧化試驗數據采用Origin 8.0軟件處理，響應面優化試驗采用Design-Expert V8.0.6軟件分析，并進行模型方差分析。

2 結果與分析

2.1 熱水浸提法提取蒲公英多糖研究

2.1.1 單因素試驗。從圖1（a）可以看出，當溫度低于80℃時，溫度與多糖得率成正相關。當溫度為80℃時，多糖的得率達到峰值，繼續升高溫度多糖得率降低。原因可能是溫度升高，分子反應速度變快，溶劑的滲透性加大，多糖分子的溶出變得更容易，但是多糖在溫度過高后容易分解，而蒲公英中黃酮等其他水溶性物質也被提取出來，與多糖發生化學反應，造成多糖含量降低[15]。因此，在80℃下提取蒲公英多糖最好。從圖1（b）可以看出，當提取時間小于2.5 h時，提取時間與多糖得率成正相關。當提取時間為2.5 h時多糖得率達到峰值，后面繼續增加提取時間，多糖得率下降。原因可能是多糖內部的糖苷鍵在持續長時間高溫條件下發生斷裂，造成得率下降。因此，2.5 h是熱水浸提法提取蒲公英多糖的最佳時間。從圖 1（c）可以看出，在液料比低于 30∶1（mL/g）時，液料比增大與蒲公英多糖的得率成正相關，即溶質的擴散動力與用水量成正相關，蒲公英中水溶性多糖更易溶解出來，使多糖得率持續增大。當液料比大于30∶1（mL/g）時，多糖得率變化較小，可能是液料比為30∶1（mL/g）時多糖幾乎全部溶出，浸出率呈現飽和狀態。因此，熱水浸提法提取蒲公英多糖的最佳液料比為 30∶1（mL/g）。

2.1.2 響應面優化試驗。采用Design-Expert V8.0.6軟件對表2中試驗結果進行多項擬合回歸，得到蒲公英多糖得率對提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C）的二次多項回歸模型方程：

表2 響應面試驗結果

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。該模型的P值＜0.000 1＜0.01，差異極顯著；失擬項的P值為0.074 6，不顯著，表明數據沒有異常點；決定系數R2=0.998 1，說明響應值的變化有99.57%來源于提取時間、提取溫度和液料比3個因素，該回歸方程能較好地展現各因素與響應值之間的關系。比較P值與F值大小，可知提取溫度（A）的影響最大，提取時間（B）次之，液料比（C）的影響最小。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗和方差分析

響應曲面坡度體現了響應值面對操作條件改變的靈敏程度，即曲面陡峭度與多糖得率對于提取溫度、提取時間、液料比3個條件的改變成正相關。由圖2可知，交互作用的影響順序為AB＞BC＞AC，即提取溫度和提取時間兩者交互作用對多糖得率的影響最顯著，提取溫度和液料比的交互作用對多糖得率的影響最小。

2.1.3 最佳工藝條件驗證。用回歸模型預計測得的熱水浸提蒲公英多糖的最佳工藝條件為提取溫度83.42 ℃、提取時間 163.2 min、液料比 32.27∶1（mL/g），在此條件下蒲公英多糖得率為66.74 mg/g。

對提取工藝條件按照實際情況進行調整，將提取溫度 83.5 ℃、提取時間 163 min、液料比 32∶1（mL/g）作為熱水浸提法提取蒲公英多糖的條件。根據調整后工藝條件設置5組平行試驗進行驗證。結果表明，熱水浸提法提取蒲公英多糖得率為（65.87±0.31）mg/g，與理論值相差微小，證明該回歸模型獲得了較準確的優化參數。

2.2 抗氧化活性測定

對最優工藝條件下提取的多糖進行抗氧化能力研究。 結果表明，蒲公英多糖對 DPPH·、OH·、O2-·3種自由基均有一定的清除作用，對DPPH·的清除能力較強[16]。

3 結論與討論

本文將單因素試驗和響應面分析法優化熱水浸提法作為提取蒲公英多糖的工藝參數。結果表明，熱水浸提法提取蒲公英多糖的最優條件為提取溫度83.5 ℃、提取時間 163 min、液料比 32∶1（mL/g），此條件下多糖得率可達65.87 mg/g。這與李婧雯等[17]研究結果相近。在各影響因素中，影響最大的是提取溫度，提取溫度和提取時間兩者交互作用對蒲公英多糖得率的影響最顯著。方差分析中決定系數R2為99.81%，變異系數為0.95%，說明本試驗數據穩定、可靠，為蒲公英多糖提取和生產提供了理論依據。

抗氧化活性測定結果表明，蒲公英多糖對DPPH·、OH·和O2-·3種自由基均有一定的清除作用，對DPPH·的清除率較強[16]，可用于天然抗氧化劑開發或功能性食品原料。綜上所述，熱水浸提法提取蒲公英多糖能提高多糖得率，為進一步開發利用蒲公英提供了參考。