消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的炎癥反應抑制作用研究

紀 薇，馬 莉，唐 潔，陳紅霞，甘賢兵

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科，安徽 合肥 230031)

痤瘡是一種常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病。雄激素誘導皮脂腺異常分泌、毛囊皮脂腺導管角化異常、痤瘡丙酸桿菌增殖、免疫炎癥反應等多種因素均與痤瘡發生相關[1]。而微生物感染一直被認為是導致痤瘡發生的重要因素之一，其中痤瘡丙酸桿菌在痤瘡患者毛囊皮脂腺中占微生物數量的89%[2]，是導致痤瘡的主要致病菌。痤瘡丙酸桿菌的增殖及其誘導的免疫炎癥反應參與痤瘡的整個發生過程。痤瘡丙酸桿菌可以在細胞因子的參與下促使細胞產生抗菌肽和金屬蛋白酶，并促進座瘡的發生[3]。因此，抑制痤瘡丙酸桿菌誘導的炎癥反應是治療痤瘡的關鍵環節。目前，臨床上針對痤瘡致病菌的外用治療主要以抗生素為主，但其存在成本高、復發率高、不良反應大[4]等問題，而中醫外治法則具有獨到的優勢。

中醫認為，痤瘡屬于“粉刺”范疇，由于熱郁，陽氣盛，肺主皮毛，肺經積熱，外感風邪，邪熱蘊結，熏蒸于面部而發，即主要是濕熱瘀毒所致[5]。筆者以清熱解毒、祛瘀生肌、利濕泄熱、活血化瘀為原則，經過多年臨床經驗積累總結配制的中藥面膜在臨床上應用療效顯著，臨床觀察表明其具有明顯的抗炎作用[6]，但具體抗炎機制仍不清楚。本研究在原有面膜基礎上進行簡化，選取其中主要成分組成消炎祛痘方(其組成為丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩)，進一步觀察消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的人單核細胞白血病細胞(THP-1細胞)炎癥反應的影響，以初步揭示其治療痤瘡的作用機制。

1 材料

1.1 細胞及菌株 THP-1細胞：中國科學研究院上海細胞庫；痤瘡丙酸桿菌標準株：合肥臻沃生物有限公司。

1.2 試藥 消炎祛痘方(藥物組成為丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩)：安徽中醫藥大學第一附屬醫院；BHI培養基、RPMI-1640培養基、96孔板、6孔板：上海胤曦生物技術有限公司；細胞計數試驗盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(批號 DCM7122)：武漢艾美捷科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)試劑盒(批號 E-EL-H0109c)、白細胞介素-1α(interleukin-1 alpha，IL-1α)試劑盒(批號 E-EL-H0088c)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒(批號 E-EL-H6008)：Elabscience Biotechnology Co.，Ltd；Trizol(批號 10296028)：Invitrogen Corporation。

1.3 儀器 熒光定量PCR儀(型號 StepOne Software)：美國Applied biosystems；CO2培養箱(型號 CCL-170B-8)：廈門精藝興業科技公司；電熱恒溫水浴槽(型號 HWS-24)：上海一恒恒溫設備廠；PVDF膜(0.22 μm，型號 ISEQ00010)：美國Millipore；電泳儀(型號 BG-subMIDI)：北京百晶生物技術有限公司。

2 方法

2.1 中藥提取物制備 取消炎祛痘方(丹參、連翹、牛蒡子、苦參、黃芩等比例配比)20 g，加蒸餾水200 mL浸泡30 min后加熱，保持微沸，煎煮45 min，過濾；藥渣加3～5倍水，煎30 min過濾。合并2次藥液，水浴濃縮至20 mL(相當于原藥材1 g/mL)，即為待測中藥水提液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2 痤瘡丙酸桿菌復蘇培養 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI培養基，37 ℃無氧條件下培養至對數生長期，得菌懸液，然后在6 700 r/m、4 ℃下離心15 min，得培養物上清液和細菌沉淀物。細菌沉淀物用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，然后懸浮在PBS中，置于80 ℃水浴中30 min以熱滅活，制成痤瘡丙酸桿菌滅活物，4 ℃保存備用[7]。

2.3 CCK-8檢測細胞活力 THP-1細胞常規復蘇培養，接種96孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，調整細胞濃度為2.5×106/mL，分別加入不同濃度(100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)的消炎祛痘方溶液，以不加入消炎祛痘方為空白對照組，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，采用CCK-8法檢測細胞活力，于450 nm處測定OD值，測定3次取平均值。細胞存活率=檢測組的OD值/空白對照組的OD值×100%[8]。

2.4 誘導炎癥細胞 收集懸浮的THP-1細胞，經細胞計數后，將細胞密度用含脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的RPMI-1640培養基調整到106/mL，鋪入24孔板，將培養的痤瘡丙酸桿菌進行離心(1 000 r/min，5 min)，每次加入1 mL的PBS進行細菌純化，重復3次，最后一次吸去廢液，用無LPS的RPMI-1640培養基重懸，按100∶1的比例將細菌與THP-1細胞[8]加入24孔培養板中，誘導12 h，以不加痤瘡丙酸桿菌作為空白對照組，光學顯微鏡下觀察，并拍照。

2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-1α、IL-8表達水平 根據CCK-8實驗結果，消炎祛痘方加藥組選擇25、12.5 μg/mL兩個濃度進行后續實驗。實驗分組為空白對照組(不加消炎祛痘方及痤瘡丙酸桿菌)、模型組(只加入痤瘡丙酸桿菌)、消炎祛痘方高劑量組(加25 μg/mL消炎祛痘方與痤瘡丙酸桿菌)、消炎祛痘方低劑量組(加12.5 μg/mL消炎祛痘方與痤瘡丙酸桿菌)。將誘導后的THP-1細胞接種于6孔板，調整細胞濃度為1×106/mL，將無細胞毒性的消炎祛痘方溶液培養24 h，采用ELISA試劑盒，按說明書檢測細胞培養上清中TNF-α、IL-1α和IL-8含量。

2.6 qRT-PCR檢測Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)、核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65)mRNA表達水平 Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。TLR2正向引物：5′-GTTGGGGGCGTTCATCTCTC-3′；反向引物：5′-CCAGACTGCGTGGTACTTG-3′。NF-κB p65正向引物：5′-AGCCGCTACAGTGTTACTCC-3′；反向引物：5′-TCCCCTGGAACTCATCTGCTA-3′。GAPDH正向引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向引物：5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。GAPDH為內參，比較循環閾值法分析基因相對含量。

2.7 Westen blot法檢測TLR2、NF-κB p65蛋白表達水平 誘導后的THP-1細胞接種于6孔板，調整細胞濃度為1×106/mL，用無細胞毒性的消炎祛痘方溶液培養24 h，裂解細胞后提取蛋白，蛋白電泳后按常規方法轉移至PVDF膜上，分別加入抗TLR2、NF-κB p65及β-actin抗體。4 ℃孵育過夜后，經HRP標記的二抗室溫孵育1 h，按ECL試劑盒說明書進行曝光、顯色。

3 結果

3.1 消炎祛痘方對THP-1細胞活力的影響 0、6.25、12.5、25、50、100 μg/L消炎祛痘方作用后THP-1細胞存活率分別為100%、98.87%、94.35%、81.85%、78.03%、62.25%。結果顯示，消炎祛痘方在25 μg/mL范圍內沒有明顯的細胞毒性作用(THP-1存活率>80%)，因此，選擇25、12.5 μg/mL兩個濃度梯度進行后續實驗。

3.2 痤瘡丙酸桿菌誘導THP-1細胞炎癥反應 痤瘡丙酸桿菌與THP-1細胞共培養前，THP-1細胞呈懸浮狀，細胞圓潤，折光率好(圖1A)；痤瘡丙酸桿菌與THP-1細胞共培養后，細胞干癟皺縮，喪失原來形態(圖1B)。結果提示，痤瘡丙酸桿菌對THP-1細胞的形態產生一定的影響。

注：A.正常THP-1細胞形態；B.痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞形態圖1 光學顯微鏡下觀察THP-1細胞及痤瘡丙酸桿菌誘導的炎癥細胞(10×10倍)

3.3 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞中TNF-α、IL-1α和IL-8表達水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達水平均顯著降低(P<0.05)；消炎祛痘方高劑量組THP-1細胞中TNF-α、IL-1α、IL-8水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖2。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖2 各組THP-1細胞中TNF-α、IL-1α、IL-8表達水平比較

3.4 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細胞中TLR2、NF-κB p65 mRNA表達水平降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；消炎祛痘方高劑量組THP-1細胞中NF-κB p65 mRNA表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖3。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖3 各組THP-1細胞中NF-κB p65、TLR2 mRNA表達水平比較

3.5 消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，模型組THP-1細胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，消炎祛痘方高、低劑量組THP-1細胞中NF-κB p65、TLR2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；高劑量消炎祛痘方組THP-1細胞中NF-κB p65蛋白表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖4。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.消炎祛痘方高劑量組；D.消炎祛痘方低劑量組；與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與消炎祛痘方低劑量組比較，△P<0.05圖4 各組THP-1細胞中TLR2、NF-κB p65蛋白表達水平比較

4 討論

痤瘡病因復雜，多與雄激素水平升高、痤瘡丙酸桿菌繁殖增多、皮脂腺分泌功能亢進、毛囊漏斗部異常角化等因素密切相關。皮脂分泌不通暢，形成角栓堵塞毛囊及皮脂腺導管，毛囊漏斗部角化增殖，同時，堵塞所造成的無氧環境也為微生物的繁殖提供了有利條件。中醫認為，痤瘡常由肺經風熱阻于肌膚而發，即主要是濕熱瘀毒所致。目前，有關中藥治療痤瘡的抗炎作用研究多集中在單味藥，如丹參具有抗氧化、抗炎，抑制皮脂腺活動[9]的作用；連翹具有降低毛細血管通透性，減少炎癥滲出的作用；黃芩具有抗菌、抑制皮脂分泌[10]的作用；苦參、牛蒡子也可能在抗炎方面發揮較大作用。但痤瘡的中醫治療應強調整體辨證論治，單方藥的作用較為局限，無法達到整體的清熱解毒、利濕泄熱等功效，而消炎祛痘方從組方上來看，正是針對痤瘡的中醫病機辨證治療，以達到清熱解毒、祛瘀生肌、利濕泄熱、活血化瘀的功效。如果能夠從現代醫學角度闡明其抗炎、抗角化作用的機制，將為外用中藥復方在痤瘡方面的治療提供重要理論依據。

研究[11]表明，痤瘡丙酸桿菌在痤瘡患者樣本中的檢出率較高，痤瘡丙酸桿菌被認為是主要致病菌。Dréno等[12]發現，痤瘡丙酸桿菌感染皮膚時通過TLRs，尤其是TLR-2和TLR-4的表達激活先天免疫，產生IL-1、IL-8、IL-12等炎癥因子，導致毛囊皮脂腺導管角化過度。湯紅燕等[13]報道痤瘡丙酸桿菌可刺激人外周單核細胞和巨噬細胞產生促炎細胞因子IL-1、IL-8和TNF-α，上述細胞因子進而與表皮、毛囊和皮脂腺內相應受體結合，參與炎癥反應。同時，NF-κB通路被認為是調節促炎因子的主要機制，是慢性炎癥反應的重要因素。在痤瘡的發生發展過程中，IL-1α起重要作用，能促進毛囊皮脂腺的角化，加重病情[14]。本研究發現，消炎祛痘方可有效抑制被痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞中炎癥因子IL-8、IL-1α、TNF-α的分泌，因此，在抑制毛囊皮脂腺角化方面可能發揮一定作用，但具體機制還需進一步研究。同時本研究顯示，消炎祛痘方能顯著降低痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞內TLR2 mRNA表達水平，起到抑制炎癥信號轉導和繼發性炎癥遞質生成的作用，并且能夠抑制痤瘡丙酸桿菌誘導的NF-κB p65表達，提示消炎祛痘方可能是通過TLR2相關信號通路來調控痤瘡丙酸桿菌誘導的炎癥反應。

本研究從消炎祛痘方對痤瘡丙酸桿菌誘導的THP-1細胞炎癥因子的影響入手，初步證明消炎祛痘方能抑制痤瘡丙酸桿菌誘導的炎癥反應，但其對下游信號通路的影響還有待進一步研究。另外，對消炎祛痘方影響IL-1α引起毛囊皮脂腺角化方面的機制還需要進一步研究。