鹽脅迫下白花前胡香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因生物信息學分析

李姚碧琪，陸海波，賈 彬，殷齊慧，張艷梅，韓邦興，歐金梅

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.皖西學院，安徽 六安 237012； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學，安徽 合肥 230038)

白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)為傘形科多年生草本植物，其干燥根被作為中藥前胡來使用，具有降氣化痰、散風清熱的功效[1]。白花前胡富含大量化學成分，如香豆素類、黃酮類、皂苷、揮發(fā)油，起主要藥理作用的成分為香豆素類化合物[2]。對白花前胡進行藥理學研究[3]發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物在心腦血管疾病、抗炎、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、抗癌和神經(jīng)保護等方面具有較高的醫(yī)療價值。

香豆素類化合物主要來源于苯丙烷代謝途徑，藥用成分是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物積累在植物器官或組織中，而產(chǎn)物積累的差異量與生物合成途徑關(guān)鍵基因的表達有關(guān)[4]。通過轉(zhuǎn)錄組差異基因的表達分析，一些研究已經(jīng)確定了香豆素類化合物合成和轉(zhuǎn)運的一些關(guān)鍵酶，在白花前胡中也克隆并驗證了幾個與香豆素生物合成有關(guān)的基因，如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)[5]、4-香豆酸：CoA連接酶(4-Coumaric acid：CoA ligase，4CL)[6]、對香豆酰CoA2′-羥化酶(p-coumaroyl CoA 2′-hydroxylase，C2′H)[7]。研究者對關(guān)鍵酶基因進行體外功能鑒定時發(fā)現(xiàn)，基因有各自不同的功能，它們具有底物特異性，用以催化香豆素的生物合成，而基因功能性的差異取決于特殊的結(jié)構(gòu)域，目前對于香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的結(jié)構(gòu)域還未有系統(tǒng)的分析。酶易受到環(huán)境因子的影響，在紫外線、冷、熱、氧化應(yīng)激和茉莉酸甲酯等不同環(huán)境條件下，關(guān)鍵酶基因?qū)γ{迫的響應(yīng)程度均有所不同，然而對鹽脅迫下各關(guān)鍵酶表達水平的變化尚未知曉。

本研究利用前期轉(zhuǎn)錄組測序、Pfam數(shù)據(jù)庫和有關(guān)生物信息學軟件，對香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因進行生物信息學分析，綜合分析其編碼蛋白家族結(jié)構(gòu)域及三級結(jié)構(gòu)，并利用熒光定量PCR分析基因在鹽脅迫下的表達變化，通過鹽脅迫試驗初步闡明關(guān)鍵酶基因在脅迫應(yīng)答中的響應(yīng)程度，為進一步解析白花前胡香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因的功能提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白花前胡香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因序列來源 課題組前期已完成白花前胡轉(zhuǎn)錄組測序[8-9]，從已報道過的文獻確定在前胡香豆素合成途徑上有明確催化活性的關(guān)鍵酶基因，分別為PAL[5]、4CL[6]、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H)[10]、C2′H[7]、咖啡酸氧-甲基類轉(zhuǎn)移酶(caffeic acid oxy-methyltransferase，COMT-S)[11]及葡萄糖醛酸酰4-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(glucuronyl 4-O-methyltransferase，GXM)[4]。PAL作為苯丙氨酸途徑的第一限速酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，C4H能催化反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為對香豆酸，4CL是苯丙氨酸分支途徑中的重要酶，負責催化合成肉桂酰CoA、對香豆酰CoA、咖啡酰CoA和阿魏酸CoA，C2′H催化生成的傘形酮為香豆素的母體，經(jīng)一系列羥基化、環(huán)化、異戊烯化等催化反應(yīng)后生成復雜香豆素成分。COMT-S及GXM為香豆素生物合成下游途徑關(guān)鍵酶，涉及的催化途徑還不清晰，但體外酶活實驗已證實可以催化香豆素的生成。

1.2 白花前胡香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因編碼蛋白的生物信息學分析 利用蛋白家族信息查詢數(shù)據(jù)庫Pfam對關(guān)鍵酶基因蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，并利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在線分析網(wǎng)站(http：//smart.embl-heidelberg.de/)和在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測網(wǎng)站(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/)對白花前胡香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶進行結(jié)構(gòu)域的分析和蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預測[12]。

1.3 白花前胡種苗培養(yǎng)和實時熒光定量PCR分析 供試材料為栽培前胡，種子從道地產(chǎn)區(qū)安徽寧國收取得來，種植前將種子置于溫水泡24 h，選擇飽滿的種子，將種子播于1/2 MS培養(yǎng)基平板上置于黑暗處發(fā)芽，選取發(fā)芽大小均一的種芽播種于盛有蛭石的塑料花盆中，置于盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中培養(yǎng)，白熾燈光照12 h、黑暗12 h，晝夜溫度分別為(25±2)℃和(18±2)℃。待白花前胡長出第4片真葉時，在李偉等[13]的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，0.15 mol/L NaCl處理后耐鹽基因CLC表達水平上升顯著，故采用0.15 mol/L 的NaCl溶液進行鹽誘導處理，分別在0、2、4、8、12、24 h等誘導時間點取下白花前胡的根組織，樣品液氮速凍后于-80 ℃保存，按照Takara公司柱式法植物RNA小量提取試劑盒提取根組織RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和多功能酶標儀進行質(zhì)量檢測，檢測合格后置于-80 ℃冰箱備用。利用Takara公司Titanium One-Step RT-PCR試劑盒將提取好的RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將反應(yīng)獲得的cDNA置于-20 ℃保存。使用引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量PCR實驗引物，參照趙玉成等的研究[14]選擇SAND基因為內(nèi)參基因，基因信息及引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息

實時熒光定量PCR反應(yīng)采用Takara公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，在Thermo Fisher的QuantStudio 5熒光定量PCR儀器上運行，每組反應(yīng)設(shè)置3個重復，熒光定量PCR擴增條件為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，61 ℃退火35 s，40個循環(huán)；溶解曲線為：97 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s；97 ℃ 1 s。熒光定量反應(yīng)體系見表2。

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程樣品的CT(threshold cycle)值，通過2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平，公式如下：ΔΔCT=(樣品目的基因CT-樣品內(nèi)參基因CT)-(對照目的基因CT-對照內(nèi)參基因CT)。將未進行鹽脅迫處理的白花前胡基因表達水平設(shè)為對照組，其值為1，分別計算出目標基因的鹽脅迫下不同時間段的相對表達水平，取3次實驗平均值即得。將鹽脅迫處理后的樣品與對照組比較，采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，使用Tukey HSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵酶基因編碼蛋白理化特性預測分析 關(guān)鍵酶基因蛋白的保守結(jié)構(gòu)域差異比較大，也暗示著它們有不同的功能[15]。PAL蛋白在64～550位上具有屬于Lyaseclass_I_like超家族的結(jié)構(gòu)域。PAL是苯丙烷途徑關(guān)鍵的生物合成催化酶，參與多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成，如黃酮類化合物、呋喃香豆素類、植物抗毒素和細胞壁成分，這些化合物對正常生長和應(yīng)對環(huán)境脅迫壓力非常重要[16]。GXM具有Polysacc_synt_4結(jié)構(gòu)域，且在12～29位上有一個跨膜螺旋區(qū)。4CL包含1個從第31位氨基酸到第443位氨基酸的AMP-binding保守功能結(jié)構(gòu)域，通過ATP依賴的AMP結(jié)構(gòu)域與底物共價結(jié)合來起作用，它們共享一個序列相似區(qū)域，該區(qū)域是一個富含Ser/Thr/gly的區(qū)域，進一步以保守的Pro-Lys-Gly三重態(tài)為特征[17]。C2′H蛋白中包含兩個結(jié)構(gòu)域：DIOX_N結(jié)構(gòu)域和2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域。在植物中，2OG-FeII_Oxy雙加氧酶域酶具有催化生成植物激素的功能，如乙烯、赤霉素、花青素和黃酮類色素[18]。C4H尤為特別，具有P450保守結(jié)構(gòu)域，細胞色素P450酶是一個血紅素單加氧酶的超家族，在植物中，這些蛋白質(zhì)對激素、防御化合物和脂肪酸等多種化合物的生物合成非常重要[19]。COMT-S蛋白在35～86位和129～357位氨基酸上具有Dimerisation和Methyltransf_2兩個保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括一系列O-甲基轉(zhuǎn)移酶，對許多植物O-甲基轉(zhuǎn)移酶cDNA克隆的預測以及氨基酸序列的比較分析表明，它們具有32%～71%的序列同源性。基因具有特殊的保守結(jié)構(gòu)域，就會發(fā)揮不同的特殊作用[20]。關(guān)鍵酶基因蛋白三維結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果見圖1所示，建模質(zhì)量較好。

注：A.PAL；B.GXM；C.4CL；D.C2′H；E.C4H；F.COMT-S圖1 關(guān)鍵酶基因蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

2.2 關(guān)鍵酶基因?qū)崟r熒光定量PCR分析 白花前胡香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因在鹽脅迫的調(diào)控下，響應(yīng)程度均有所不同。PAL和4CL為苯丙烷上游途徑關(guān)鍵酶，C4H和C2′H為苯丙烷中游途徑關(guān)鍵酶，COMT-S和GXM為苯丙烷下游途徑關(guān)鍵酶。各個基因在鹽脅迫下均表現(xiàn)出不同的表達模式，具體表達水平的影響見圖2、圖3。在0.15 mol/L NaCl脅迫過程中，處理2 h后與對照組相比，PAL和4CL基因表達水平明顯上升，而其余均明顯下降；處理4 h后，PAL、4CL、C4H和C2′H表達水平均有所上升，尤其是PAL和4CL達到峰值，比對照組上升了1.2倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。8 h后，4CL和C2′H基因表達水平有所上升，12 h后，PAL、4CL和C4H基因表達水平上升；當處理24 h后，4CL和C4H基因表達量比對照組略微上調(diào)。而下游途徑COMT-S和GXM基因表達量在不同鹽脅迫處理時間下較對照組均明顯下降。

圖2 香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達水平熱圖

注：與0 h比較，*P<0.05圖3 在鹽脅迫過程中白花前胡香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達水平比較

根作為直接與土壤接觸的器官，不但要吸收水分和養(yǎng)分，也會生成多種次生代謝產(chǎn)物，在鹽脅迫條件下，根系活力與生長狀況將直接影響植物的生長發(fā)育，植物在鹽脅迫下受到誘導表達增強的基因，可能與其參與鹽脅迫調(diào)控有關(guān)[21]。本實驗系統(tǒng)分析了白花前胡香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的保守結(jié)構(gòu)域，關(guān)鍵酶基因編碼蛋白含有各自特殊的保守結(jié)構(gòu)域，也有著特殊的功能，通過對基因在鹽脅迫下的表達水平變化分析發(fā)現(xiàn)基因表達趨勢各有所不同。與對照組比較，5個時間段的4CL在鹽脅迫下的表達均有不同程度的上升；在鹽脅迫處理2、4、12 h時，PAL基因表達出現(xiàn)上升趨勢。PAL通常對植物的逆境脅迫應(yīng)答起到重要作用。C4H在受到鹽脅迫4、12、24 h時，表達活性得到增加，C4H是苯丙烷途徑的第2個關(guān)鍵酶，屬于細胞色素單加氧酶P450超家族成員，其表達活性受到環(huán)境因素的重要影響。逆境脅迫下，植物可通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強植物的抗逆性，上述基因的表達水平在受到鹽脅迫后上升，推測其可能提高植物對鹽脅迫的耐受性。然而，香豆素生物合成關(guān)鍵酶在鹽脅迫時涉及的具體通路和作用還有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，白花前胡香豆素生物合成關(guān)鍵酶基因在鹽脅迫環(huán)境下，基因表達水平出現(xiàn)不同的響應(yīng)程度，提示鹽逆境因子對調(diào)控白花前胡香豆素的生物合成具有極其重要的作用，為研究編碼關(guān)鍵酶基因的蛋白家族奠定了基礎(chǔ)，對進一步揭示和利用白花前胡香豆素合成途徑關(guān)鍵酶基因的功能提供理論依據(jù)。