響應面法優化赤芝、紫芝子實體總三萜提取工藝

李思雨，張 靜，崔馨戈，祝朋玲，袁抒捷，王 雯，周 俊，彭 燦，3，4,5,6

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600; 3. 中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4. 安徽省中醫藥研究院中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012;5. 藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012; 6.省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥 230012)

靈芝作為中國珍貴的藥食同源類中藥材，是“十大皖藥”之一，始載于《神農本草經》，《中華人民共和國藥典》記載其為赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.) Karst.、紫芝GanodermasinenseZhao, Xu et Zhang的干燥子實體。中醫以陰陽五行學說將靈芝分為五芝，其中赤芝主治胸中結，可益心氣、補中，增慧智，令人不忘；紫芝主治耳聾，可利關節、保神、益精氣、堅筋骨、養容顏。現代研究表明，赤芝對心腦血管疾病[1-2]引起的心悸、心律不齊等效果較好，紫芝有調節免疫功能[3-5]、抑制細菌[6-7]、治療骨損傷[8]等作用。

靈芝所含有的化學成分多樣，其中三萜類化合物作為靈芝的主要活性成分之一，具有多種藥理作用[9-12]。既往研究[13]表明，赤芝與紫芝之間的三萜類成分存在差異，應基于品種特點建立一種高效簡便的靈芝三萜提取方法。目前，用于提取靈芝中三萜的方法有索氏回流提取、超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲波提取等[14]，其中超聲波法在中草藥提取方面具有優越性，不僅超聲時間短，還可加速靈芝中三萜成分的釋放，而且操作簡便，溶劑消耗低。

基于此，本研究旨在優化赤芝、紫芝子實體中總三萜超聲提取工藝，為系統研究赤芝、紫芝成分差異及后續產品開發奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 BT25S十萬分之一分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司；UV-1900型紫外-可見分光光度計：上海元析分析儀器有限公司； YL-060S型超聲波清洗機：山東省濟南巴克超聲波科技有限公司。

1.2 試劑 赤芝、紫芝子實體(經安徽中醫藥大學楊青山副教授鑒定為多孔菌科赤芝Ganodermalucidum、紫芝Ganodermasinense子實體)：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司；無水甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純)、香草醛(分析純)、乙酸乙酯(分析純)：上海潤捷化學試劑有限公司；高氯酸(優級純)：國藥集團化學試劑有限公司；齊墩果酸對照品(色譜純，純度≥98%，批號 CHB171229)：成都克洛瑪生物科技有限公司。

2 方法

2.1 齊墩果酸標準曲線的繪制及靈芝子實體總三萜的提取

2.1.1 標準曲線的繪制 精密稱定齊墩果酸對照品適量，加甲醇配制成0.2 mg/mL的對照品溶液，備用。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，冷卻，然后加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后在70 ℃水浴中加熱15 min，迅速置冰浴中冷卻，5 min后取出，之后準確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[《中華人民共和國藥典》(四部)通則0401]，在546 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.1.2 靈芝總三萜得率測定 將超聲提取后的提取液按照“2.1.1”項下方法測定其吸光度，并通過回歸方程計算出總三萜質量，根據得到的靈芝子實體總三萜質量與原料質量，計算靈芝子實體總三萜的得率。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溶劑的選擇及溶劑容積分數的選擇 準確稱取赤芝、紫芝子實體粉末2.00 g，料液比為1∶20 g/mL、超聲時間為20 min、超聲溫度為50 ℃，用于提取靈芝，考察甲醇或乙醇溶劑以及溶劑容積分數為20%、40%、60%、80%、100%條件下赤芝、紫芝總三萜得率。

2.2.2 料液比的選擇 準確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分數由“2.2.1”項確定，超聲時間為20 min、超聲溫度為50 ℃，以靈芝子實體全部浸于甲醇中為起始值，即1∶20 g/mL，故考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL條件下赤芝、紫芝總三萜得率。

2.2.3 超聲時間的選擇 準確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分數由“2.2.1”項確定，料液比由“2.2.2”項確定，超聲溫度為50 ℃，考察超聲時間為10、20、30、40、50 min條件下的赤芝、紫芝總三萜得率。

2.2.4 超聲溫度的選擇 準確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分數由“2.2.1”項確定，料液比由“2.2.2”項確定，超聲時間由“2.2.3”項確定，考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下赤芝、紫芝總三萜得率。

2.3 Box-Behnken響應面試驗設計 根據單因素實驗結果，考察超聲溫度(A)、超聲時間(B)、料液比(C)3個因素對靈芝子實體總三萜得率的影響，設計Box-Behnken響應面試驗。見表1。

表1 Box-Behnken響應面試驗因素和水平

3 結果

3.1 標準曲線的建立 按照“2.1.1”項下方法得到齊墩果酸線性回歸方程：y=9.03x+0.042 2，R2=0.999 2。式中y為吸光值；x為齊墩果酸濃度。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 溶劑及其容積分數的選擇 本實驗觀察了無水甲醇和無水乙醇對靈芝總三萜得率的影響。以甲醇為提取溶劑時，赤芝、紫芝子實體中總三萜得率分別為1.12%、0.62%；以乙醇為提取溶劑時，赤芝、紫芝子實體中總三萜得率分別為0.88%、0.46%。圖1顯示不同容積分數的甲醇對赤芝、紫芝中總三萜得率的影響，結果表明以100%甲醇為提取溶劑時，靈芝子實體中總三萜得率最高。

圖1 甲醇容積分數對靈芝子實體總三萜得率的影響

3.2.2 料液比的選擇 在1∶20 g/mL至1∶40 g/mL料液比范圍內，靈芝總三萜得率逐漸升高，在料液比為1∶40 g/mL時總三萜得率最高，之后得率反而隨著料液比的增加而降低。見圖2。此現象產生的原因：起初靈芝粉末和溶劑的接觸面積隨著液料比的增加而擴大，更有利于總三萜的提取，但料液比超過1∶40 g/mL后，溶質已經達到溶解平衡，故提取率不再增加。因此，料液比選用1∶40 g/mL為宜。

圖2 料液比對靈芝子實體總三萜得率的影響

3.2.3 超聲時間的選擇 由圖3可知，適當延長超聲時間能夠提高靈芝總三萜的得率，當超聲時間為30 min時得率最大。但當繼續延長超聲時間時，得率卻呈現下降的趨勢。因此，超聲時間應選在30 min為宜。

圖3 超聲時間對靈芝子實體總三萜得率的影響

3.2.4 超聲溫度的選擇 由圖4可知，當超聲溫度為50 ℃時，靈芝子實體總三萜的得率達到峰值，進一步升高超聲溫度，得率反而下降。因此，超聲溫度應以50 ℃為最佳選擇。

圖4 超聲溫度對靈芝子實體總三萜得率的影響

3.3 Box-Behnken響應面試驗結果

3.3.1 靈芝子實體響應面結果及驗證實驗 Box-Behnken試驗設計17個三因素、三水平的試驗，分別得出赤芝、紫芝子實體中總三萜的得率。見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果

3.3.2 赤芝子實體中總三萜提取工藝的Box-Behnken響應面試驗結果分析 以靈芝子實體總三萜得率為響應值，將表2中赤芝、紫芝子實體中總三萜得率數據進行響應面回歸分析，可得到赤芝子實體中總三萜提取工藝的回歸方程:Y=1.19+0.042 50A+0.005 9B-0.018 7C+0.005 5AB-0.023 4AC+0.002BC-0.074 2A2-0.082 8B2-0.033C2；紫芝子實體總三萜提取工藝的回歸方程：Y=0.909 25+0.033 1A+0.004 4B-0.016 2C+0.004AB+0.018 4AC-0.000 2BC-0.054 7A2-0.062 3B2-0.026 6C2，式中Y為總三萜得率，A為超聲溫度，B為超聲時間，C為料液比。

表3 赤芝子實體總三萜提取工藝的Box-Behnken響應面試驗方差分析結果

表4 紫芝子實體總三萜提取工藝的Box-Behnken響應面試驗方差分析結果

3.3.3 Box-Behnken響應面試驗圖形分析 依據響應面分析試驗結果，運用Design Expert 13軟件進行回歸擬合分析，得到液料比、超聲時間、超聲溫度對靈芝子實體總三萜得率的影響，三維響應面圖見圖5、圖6、圖7。

a.赤芝響應面圖；b.紫芝響應面圖圖5 溫度和時間的交互作用對靈芝子實體總三萜提取率的影響

a.赤芝響應面圖；b.紫芝響應面圖圖6 溫度和料液比的交互作用對靈芝子實體總三萜提取率的影響

a.赤芝響應面圖；b.紫芝響應面圖圖7 料液比和時間的交互作用對靈芝子實體總三萜提取率的影響

從圖5可以看出，溫度與時間的交互作用接近正圓形，說明這兩者交互作用較小，對靈芝總三萜得率影響不大。而圖6、圖7中料液比與超聲時間、超聲溫度和料液比的交互作用接近橢圓形，表明兩者的交互作用較大，對靈芝總三萜得率影響較大，其中超聲溫度與料液比對靈芝總三萜得率的交互作用具有統計學意義(P<0.05)，這與表3、表4中方差分析的結果一致。

3.3.4 赤芝、紫芝子實體總三萜最佳工藝條件的確定及驗證試驗

利用Design-Expert 13軟件對赤芝、紫芝子實體總三萜的Box-Behnken響應面試驗結果進行優化，得出赤芝子實體總三萜的最佳提取條件：料液比為1∶38.09 g/mL，超聲時間為30.416 min，超聲溫度為52.584 ℃，最佳條件下，總三萜預測最高提取率為1.194%；得出紫芝子實體總三萜的最佳提取條件：料液比為1∶27.787 g/mL，超聲時間為30.444 min，超聲溫度為52.685 ℃。最佳條件下，總三萜預測最高提取率為0.915%。為檢驗預測結果的可靠性，兼顧操作的便利性，將赤芝子實體總三萜最佳提取條件進行修正：料液比為1∶38 g/mL，超聲時間為30 min，超聲溫度為53 ℃；將紫芝子實體總三萜最佳提取條件修正為：料液比為1∶28 g/mL，超聲時間為30 min，超聲溫度為53 ℃。進行3次重復試驗，測得赤芝子實體總三萜的平均提取率為1.202 3%，與預測值比較，其RSD值為1.13%；紫芝子實體總三萜的平均提取率為0.923 7%，與預測值比較，其RSD值為0.86%。結果表明，Box-Behnken響應面試驗優選的赤芝、紫芝子實體提取工藝模型真實、可靠，適用于其子實體總三萜的提取。

4 討論

本研究在單因素實驗的基礎上，依據Box-Behnken實驗設計并采用Design-Expert 13軟件分析優化赤芝、紫芝子實體總三萜提取工藝。得到赤芝子實體總三萜最佳提取條件：料液比為1∶38 g/mL，超聲時間為30 min，超聲溫度為53 ℃；紫芝子實體總三萜最佳提取條件：料液比為1∶28 g/mL，超聲時間為30 min，超聲溫度為53 ℃。兩個品種的預測值和實驗值之間具有良好的相關性，說明此模型可靠，可運用于超聲提取赤芝、紫芝子實體中總三萜的工藝研究。

靈芝作為珍貴的藥食同源類中藥材，所含成分應用廣泛，在醫藥、保健、化妝品及食品行業潛力較大，是天然的食用、藥用滋補良品。響應面法可對單因素的作用以及因素之間的交互作用進行回歸分析，能克服正交試驗設計只能剖析離散數據、預測性不高的弊端。本研究結果表明，在優化的提取條件下，赤芝子實體中總三萜提取得率較紫芝子實體更高，本研究可為進一步精確分析赤芝、紫芝中差異成分提供實驗依據，為后續產品開發奠定基礎。