正交試驗(yàn)結(jié)合熵權(quán)TOPSIS優(yōu)選麻黃-桂枝藥對水提工藝△

黃瑤，徐杰，劉佩儀，鄧韜，黃夢婷，魏梅，梁志毅*，劉路芳

1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

中藥藥對是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，以治則治法、中藥藥性為前提，以七情配伍理論為依據(jù)進(jìn)行的藥物組合配對[1]。麻黃發(fā)汗解表，善行肌表衛(wèi)分，開腠理、透毛竅；桂枝發(fā)汗解肌，助麻黃解表散邪，以增強(qiáng)其發(fā)汗之功，兩者相須配伍即為臨床常用的辛溫解表藥對——麻黃-桂枝藥對。其源于張仲景所著《傷寒論》的麻黃湯，在大青龍湯、小青龍湯、桂枝芍藥知母湯等經(jīng)典方劑中均有應(yīng)用[2]。

麻黃-桂枝藥對在中醫(yī)臨床上的用法多以口服湯劑為主，為便于患者服用、攜帶和儲(chǔ)存，擬采用水提方式將其制備成顆粒劑。復(fù)方水提液中活性成分含量在煎煮過程中易受到加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)等因素影響，因此中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量和療效與其提取工藝直接相關(guān)[3]。中藥指紋圖譜作為中藥整體化學(xué)物質(zhì)的表征，能夠較為直觀、全面地反映不同提取工藝條件對復(fù)方中藥物質(zhì)成分的影響[4-5]。因此，本研究擬采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以煎煮次數(shù)、加水量和煎煮時(shí)間為考察因素，以指紋圖譜及醇溶性浸出物含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選麻黃-桂枝藥對水提工藝，以期為麻黃-桂枝藥對的工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型高效液相色譜（UPLC）儀（美國Waters 公司）；Milli-QDirect 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 股份有限公司）；B-290 型噴霧干燥機(jī)（瑞士步琪有限公司）；TC-15 型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；DLSB-5L/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵、YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201508，純度：99.8%）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)：171237-201208，純度：99.9%）、肉桂酸（批號(hào)：110786-201604，純度：98.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜級(jí)甲醇、乙腈均購自德國Merck 股份有限公司；色譜級(jí)磷酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

麻黃藥材（批號(hào)：2005011）購自內(nèi)蒙古吉隆生態(tài)科技有限責(zé)任公司、桂枝藥材（批號(hào)：2006006）購自肇慶市高要區(qū)綠福農(nóng)業(yè)種植專業(yè)合作社，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃-桂枝藥對的制備

取麻黃藥材，除去木質(zhì)莖、殘根及雜質(zhì)，切段，得麻黃飲片。取桂枝藥材，揀選除去雜質(zhì)，得桂枝飲片。按麻黃湯中麻黃-桂枝配伍比（3∶2）稱取麻黃飲片約60 g、桂枝飲片約40 g，加水煎煮，煎液濾過，減壓濃縮，噴霧干燥，制粒，即得麻黃-桂枝藥對配方顆粒，簡稱麻黃-桂枝藥對。

2.2 指紋圖譜測定方法建立

2.2.1供試品溶液的制備 取麻黃-桂枝藥對，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2對照品溶液的制備 分別取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、肉桂酸對照品適量，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為125.149、103.097、32.999 μg·mL-1的混合對照品溶液。另取甲醇作為陰性對照溶液。

2.2.3色譜條件 色譜柱：Waters HSST3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%的磷酸水溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，3%～7%A；10～17 min，7%～9%A；17～35 min，9%～10%A；35～36 min，10%～17%A；36～50 min，17%～24%A；50～70 min，24%～45%A）；柱溫：35 ℃；流速：0.25 mL·min-1；檢測波長：210 nm（0～35 min）、280 nm（35～70 min）；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.4精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以3 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間與相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件測定，以3 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間與相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取麻黃-桂枝藥對樣品6份，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件測定，以3 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間與相對峰面積RSD 均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以煎煮次數(shù)（A）、加水量（B）、煎煮時(shí)間（C）為考察因素，各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，采用L9（34）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1 麻黃-桂枝藥對水提工藝正交試驗(yàn)因素與水平

2.4 指紋圖譜共有峰的確定及色譜峰的指認(rèn)

按2.3項(xiàng)下正交試驗(yàn)因素與水平條件，按2.1項(xiàng)下方法制備麻黃-桂枝藥對，編號(hào)分別為S1～S9。分別取制備的麻黃-桂枝藥對樣品，按照2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下色譜條件測定，將采集的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）進(jìn)行共有峰匹配，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正生成對照圖譜R，見圖1。結(jié)果顯示，正交試驗(yàn)9 個(gè)樣品的UPLC 指紋圖譜共標(biāo)定了18 個(gè)峰，各樣品與對照指紋圖譜的相似度分別為0.989、0.996、1.000、1.000、0.999、0.999、0.995、1.000、0.997，相似度均在0.9 以上，滿足指紋圖譜研究的要求。與對照品進(jìn)行比對，指認(rèn)了峰3、峰4、峰16 分別為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、肉桂酸，見圖2。計(jì)算各共有峰“峰面積/稱樣量”值，結(jié)果見表2。

表2 麻黃-桂枝藥對正交試驗(yàn)共有峰“峰面積/稱樣量”值

圖1 麻黃-桂枝藥對UPLC指紋圖譜

圖2 麻黃-桂枝藥對特征峰指認(rèn)

2.5 浸出物含量測定分別取S1～S9 麻黃-桂枝藥對樣品，參照《中華

人民共和國藥典》2020 年版（四部）浸出物項(xiàng)下醇溶性浸出物含量測定方法（熱浸法）測定[6]。結(jié)果顯示，9 個(gè)不同工藝制備的樣品醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50.74%、50.35%、51.06%、50.82%、51.15%、51.39%、49.21%、51.47%、50.16%，RSD 為1.40%，各工藝樣品間的醇溶性浸出物含量差異不大，說明單以醇溶性浸出物含量為指標(biāo)優(yōu)選的水提工藝不具顯著代表性。

2.6 熵權(quán)TOPSIS分析

2.6.1建立初始決策矩陣 按照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的熵權(quán)TOPSIS分析的步驟，以測得的指紋圖譜共有峰的“峰面積/稱樣量”和浸出物含量為評價(jià)指標(biāo)建立原始指標(biāo)矩陣。假設(shè)有m個(gè)樣本（A1，A2，A3，......，Am)，有n個(gè)決策指標(biāo)（B1，B2，B3，......，Bn），樣本i（i=1，2，3，......，m）在決策指標(biāo)j（j=1，2，3，......，n）下的測量值為Xij，初始決策矩陣V見公式（1）。Xij即為第i個(gè)樣品的第j個(gè)指標(biāo)的測定值；其中j=1，2，3，......，18 時(shí)，j分別為峰1～18 的“峰面積/稱樣量”值，j=19時(shí)，j為浸出物含量測定值。

2.6.2建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣 由于麻黃-桂枝藥對提取物各個(gè)指標(biāo)成分存在量綱不一致的問題，因此需要對初始決策矩陣進(jìn)行同向化歸一處理，建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣R。根據(jù)公式（2）對其各指標(biāo)進(jìn)行同向化處理。

式中，max、min（X1j，X2j，X3j，......，Xmj）表示所有樣品i（i=1，2，3，......，9）在評價(jià)指標(biāo)j（j=1，2，3，......，19）下的最大值、最小值。

2.6.3熵值法確定各指標(biāo)權(quán)重 權(quán)重指標(biāo)大小會(huì)對最終結(jié)果的科學(xué)性和合理性產(chǎn)生影響，因此需要對各指標(biāo)進(jìn)行合理的賦值。信息熵是系統(tǒng)無序程度的度量，指標(biāo)數(shù)據(jù)越離散，熵值（Ej）越小，說明該指標(biāo)提供的有效信息越大，對綜合評價(jià)的影響也就越大。熵值法計(jì)算指標(biāo)權(quán)重（wj）可以有效排除主觀因素的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加客觀，Ej和wj按公式（3）、（4）。

2.6.4建立加權(quán)決策矩陣 將標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣與各指標(biāo)的權(quán)重相乘即得加權(quán)決策矩陣Z，確定最優(yōu)向量Z+和最劣向量Z-。

2.6.5貼近度的計(jì)算及評價(jià) 根據(jù)最優(yōu)方案和最劣方案，計(jì)算不同工藝麻黃-桂枝藥對樣品與最優(yōu)向量Z+和最劣向量Z-的距離D。計(jì)算每個(gè)評價(jià)對象與最優(yōu)方案的接近程度Ci，并根據(jù)Ci對評價(jià)對象進(jìn)行排序。Ci在［0，1］區(qū)間，越接近1表示該評價(jià)對象越接近最優(yōu)水平，越接近0 表示該評價(jià)對象越接近最劣水平。

2.6.6熵權(quán)TOPSIS 分析結(jié)果 本研究測定的各共有峰“峰面積/稱樣量”和浸出物含量為高優(yōu)指標(biāo)，采用公式（2）進(jìn)行同向化處理，建立標(biāo)準(zhǔn)決策矩陣。按公式（3）、（4）計(jì)算各評價(jià)指標(biāo)的Ej和wj，得到wj分別為0.035 4、0.100 4、0.040 2、0.038 0、0.057 3、0.048 7、0.036 8、0.052 0、0.039 8、0.068 6、0.057 7、0.029 7、0.060 1、0.041 3、0.056 7、0.063 1、0.065 6、0.075 1、0.033 7。按照公式（5）將同向化處理后的數(shù)據(jù)與各指標(biāo)的wj相乘建立標(biāo)準(zhǔn)決策矩陣。按照公式（6）、（7）分別計(jì)算最優(yōu)向量Z+分別為0.035 4、0.100 4、0.040 2、0.038 0、0.057 3、0.048 7、0.036 8、0.052 0、0.039 8、0.068 6、0.057 7、0.029 7、0.060 1、0.041 3、0.056 7、0.063 1、0.065 6、0.075 1、0.033 7，最劣向量Z-均為0。分別按照公式（8）、（9）計(jì)算D，按照公式（10）計(jì)算Ci，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，工藝1～9 得到的Ci分別為0.406 3、0.461 5、0.419 1、0.423 0、0.614 1、0.553 6、0.496 9、0.670 2、0.452 5，Ci的RSD 為18.7%，表明不同工藝之間的綜合質(zhì)量差異較大，工藝8 的Ci在所有工藝排名中第一，表明工藝8在正交試驗(yàn)所有工藝中最優(yōu)。

表3 麻黃-桂枝藥對水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對正交試驗(yàn)進(jìn)行極差和方差分析，結(jié)果見表3～4。根據(jù)極差分析結(jié)果可知，各因素對麻黃-桂枝藥對提取工藝綜合指標(biāo)的影響排序?yàn)锽＞A＞C，即加水量＞煎煮次數(shù)＞煎煮時(shí)間；以空白列為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，3 個(gè)因素對提取工藝影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），確定麻黃-桂枝藥對最優(yōu)水提工藝為A3B2C1，即加投料量10 倍量的水，煎煮3 次，每次煎煮30 min。

表4 麻黃-桂枝藥對水提工藝正交試驗(yàn)方差分析

2.8 優(yōu)選的正交工藝驗(yàn)證

按照優(yōu)選的水提工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定指紋圖譜和浸出物。結(jié)果顯示，3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得麻黃-桂枝藥對樣品指紋圖譜中共有峰的“總峰面積/稱樣量”值分別為26 702 991、27 536 940、27 584 058，RSD 為1.82%；醇溶性浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為53.70%、52.33%、51.88%，RSD 為1.80%，表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

3.1 水提工藝指標(biāo)的選擇

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備的9 個(gè)不同工藝麻黃-桂枝藥對樣品中醇溶性浸出物含量差異不大，不足以區(qū)分不同工藝的優(yōu)劣，說明以單一指標(biāo)進(jìn)行水提工藝的優(yōu)選存在一定局限性。中藥復(fù)方是多成分協(xié)同發(fā)揮療效的，而中藥指紋圖譜可以比較全面地反映其所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能夠更有效地體現(xiàn)出中藥成分的整體性和綜合作用。本研究建立的麻黃-桂枝藥對指紋圖譜共標(biāo)定了18個(gè)共有峰，其中指認(rèn)的鹽酸麻黃堿（峰3）、鹽酸偽麻黃堿（峰4）、肉桂酸（峰16）是麻黃、桂枝的主要藥效成分，以此18 個(gè)共有峰及醇溶性浸出物為綜合評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選的麻黃-桂枝藥對水提工藝，結(jié)果更具代表性。

3.2 綜合加權(quán)評分法的選定

中藥作為一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，以單一成分含量作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選關(guān)聯(lián)藥效的中藥提取工藝存在一定的片面性。而采用多指標(biāo)成分進(jìn)行綜合評價(jià)時(shí)，各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)則直接影響最終的評價(jià)結(jié)果。熵權(quán)TOPSIS是一種客觀賦權(quán)法，根據(jù)原始數(shù)據(jù)矩陣之間的關(guān)系來確定權(quán)重，不依賴于人的主觀判斷，決策或評價(jià)結(jié)果具有較強(qiáng)的數(shù)學(xué)理論依據(jù)，具有處理復(fù)雜多量數(shù)據(jù)的分析優(yōu)勢[8]。本研究以麻黃-桂枝藥對指紋圖譜（18個(gè)共有峰）及醇溶性浸出物為評價(jià)指標(biāo)，涉及19 個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，采用熵權(quán)TOPSIS 可避免人為賦權(quán)的主觀性，結(jié)果更為客觀、科學(xué)、合理。

本研究結(jié)合指紋圖譜與熵權(quán)TOPSIS，采用正交設(shè)計(jì)考察煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時(shí)間等因素，優(yōu)選麻黃-桂枝藥對的最佳水提工藝為加10倍量水，煎煮3 次，每次煎煮30 min。該方法可為麻黃-桂枝藥對的工業(yè)生產(chǎn)提供參考。