產β-葡萄糖苷酶乳酸菌益生特性研究

馮程程，蔡子哲，陳瓊，歐仕益，謝小冬，汪勇，MARTIN J T REANEY，張寧*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)2(廣東省油料生物煉制與營養安全國際聯合研究中心，廣東 廣州，510632)3(暨南大學-薩斯喀徹溫大學“油料生物煉制與營養”聯合實驗室，廣東 廣州，510632) 4(廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州，510663)5(加拿大薩斯喀徹溫大學 農業與生物資源學院，加拿大 薩斯卡通，S7N5A8)

β-葡萄糖苷酶能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[1]。β-葡萄糖苷酶的應用非常廣泛，包括使木酚素、大豆異黃酮、人參皂苷和虎杖苷等糖苷類物質脫去糖基轉化為具有更高生物利用度的苷元[2]；將水果、果汁中的糖苷鍵合態物質水解為具有香氣的萜烯醇類化合物以及芳香醇氧化物，從而起到酶解增香作用[3]；和α-L-鼠李糖苷酶組成柚苷酶，可用于水解柑橘類果實中重要的苦味物質柚皮苷，有效減少食品的苦澀味[4]；應用于水解β-糖苷鍵，生產具有防齲齒、提神、抗疲勞等功效的低聚糖(如龍膽糖)[5]；以及催化葡萄糖和脂肪醇生成易生物降解、環境友好的非離子表面活性劑烷基糖苷[6]，具有巨大的生物技術應用前景。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，利用微生物產β-葡萄糖苷酶繁殖周期短，成本低，利于工業化生產，其中黑曲霉產β-葡萄糖苷酶效率較高[7]。然而，霉菌的使用會影響產品的風味，且一般需要制成酶制劑再添加到食品中。與霉菌相比，乳酸菌作為益生菌具有益生功效，而且可以直接加入食品體系[8]。

益生菌必須耐受胃液的強酸性環境，以保證順利抵達人體腸道，黏附并定植在腸道內，才能發揮益生作用[9]。本研究以3株乳酸菌為對象，研究其不同碳源誘導下的β-葡萄糖苷酶活力，通過耐受模擬人工胃腸液、耐膽鹽、自聚集及疏水性、溶血性、抗生素藥敏性等試驗進行益生特性研究，以期為開發優良的高產β-葡萄糖苷酶的益生菌菌株提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)C1和C5，課題組自有菌株；堅強腸球菌(Enterococcusdurans)GW18275，廣州市微生物研究所。

1.2 材料與試劑

胃蛋白酶、胰蛋白酶、MRS肉湯、哥倫比亞血瓊脂平板，廣東環凱生物科技有限公司；Na2CO3、二甲苯、纖維二糖、對硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG)、對硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)，上海麥克林生化科技有限公司；膽鹽，上海源葉生物科技有限公司；MRS瓊脂培養基、無糖MRS肉湯，青島海博生物技術有限公司；抗生素藥敏紙片，廣州科原儀器設備有限公司；正己烷、乙酸乙酯，廣東光華科技股份有限公司。

1.3 儀器與設備

Alpha-1506紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；DSX-24L-1手提式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；CJ-1D超凈工作臺，泰斯特儀器有限公司；KDC-220HR高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；HCS-165A-A BOD生化培養箱，廣州恒創實驗儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 乳酸菌在MRS-纖維二糖平板生長狀況

無糖MRS瓊脂培養基中加入20 g/L纖維二糖制成MRS-纖維二糖平板，將3株乳酸菌于MRS-纖維二糖平板劃線，37 ℃培養24～48 h，觀察菌株是否生長。

1.4.2 乳酸菌β-葡萄糖苷酶活力測定

將菌株以2%(體積分數)的接種量接種于5 mL碳源分別為葡萄糖和纖維二糖的MRS肉湯培養基中活化18 h，將菌液在4 ℃下6 000 r/min離心10 min，取離心沉淀用生理鹽水溶液洗滌2次后，加入1 mL生理鹽水混勻作為粗酶液。取100 μL粗酶液加入1.8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液在37 ℃下水浴5 min，然后加入100 μL底物p-NPG(20 mmol/L)，空白組改用100 μL緩沖液替代粗酶液。反應30 min之后加入1 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。離心除去菌體，400 nm下測量其紫外吸收，參考錢超[1]的方法繪制標準曲線。酶活力單位(U)定義為上述條件下，每分鐘催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。酶活力的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：U，酶活力，U/mL；c，p-NP的濃度,μmol/L；V，反應體系的體積,L；N，原酶液稀釋倍數；t，反應時間,min；0.1，所取上清液或細胞液的體積。

1.4.3 溶血性

將乳酸菌菌株于體積分數5%的羊血哥倫比亞血瓊脂平板劃線，37 ℃培養24 h，觀察菌株在平板上的溶血情況[10]。

1.4.4 抗生素敏感性

根據PISANO等[11]的方法，采用紙片擴散法評估乳酸菌的抗生素敏感性。選擇了5類共10種抗生素：頭孢菌素類(頭孢拉定、頭孢噻肟、頭孢他啶)、四環素類(四環素)、氨基糖苷類(新霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星)、β-酰胺類(青霉素)、大環內酯類(阿奇霉素)。將每種乳酸菌菌株100 μL涂抹在MRS瓊脂平板上，并將含有相應抗生素的紙片放在平板上。37 ℃培養48 h后，測量抑菌區的直徑。

1.4.5 模擬胃腸液耐受性

根據SON等[12]的研究對乳酸菌菌株對模擬胃腸道液體耐受性進行評估。培養過夜的乳酸菌菌株4 ℃下6 000 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，用緩沖液調整菌體濃度，制成在600 nm下吸光值約為1.000的菌懸液。參考《中國藥典》2010版配制模擬胃腸液，量取1 mol/L HCl溶液20 mL，用NaOH溶液將其pH調至3，加入胃蛋白酶使其終濃度為10 g/L，0.22 μm微孔濾膜除菌制成模擬胃液。將1 mL待測菌懸液接種于9 mL pH=3.0的人工胃液中，37 ℃孵育3 h。測定活菌數，計算存活率。取KH2PO46.8 g，加水500 mL使之溶解，用NaOH溶液將其pH調至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，0.22 μm微孔濾膜除菌制成模擬腸液。將1 mL人工胃液消化的懸液接種于9 mL pH=6.8的人工模擬腸液中，在37 ℃下培養4 h，測定活菌數，存活率按公式(2)計算：

(2)

式中：n1，菌株處理后的活菌數，CFU/mL；n0，菌株初始活菌數，CFU/mL。

1.4.6 膽鹽耐受性

將培養過夜的乳酸菌菌株接種于含3 g/L膽鹽的MRS肉湯中，37 ℃孵育4 h。用MRS瓊脂平板計數法測定菌株的存活率[12]。存活率按公式(3)計算：

(3)

式中：n4 h，菌株處理后的活菌數，CFU/mL；n，初始活菌數，CFU/mL。

1.4.7 自聚集率

將調整濃度后的乳酸菌菌懸液于37 ℃分別放置4和24 h，分別在0、4、24 h時，在600 nm處測定上清液吸光度[13]。自聚集率按公式(4)計算：

(4)

式中：At，處理4或24 h的吸光度；A0，乳酸菌菌懸液初始吸光度。

1.4.8 疏水性

參照KLAYARAUNG[14]的方法，選擇二甲苯、正己烷、乙酸乙酯3種有機溶劑測試菌株疏水性。將3 mL調整濃度后的乳酸菌菌懸液與1 mL有機溶劑混合渦旋振蕩2 min，37 ℃靜置3 h分離水相與有機相，取水相測其吸光度。疏水性的計算如公式(5)所示：

(5)

式中：A1，乳酸菌菌懸液初始吸光度；A2，水相吸光度。

1.4.9 活菌數的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法，取1.0 mL待測菌液與9.0 mL的0.85%(質量分數)的生理鹽水混勻，梯度稀釋至10-5、10-6、10-7，取稀釋液100 μL，涂布于MRS瓊脂平板，37 ℃培養24～48 h，計算乳酸菌活菌數。

1.4.10 數據分析與處理

試驗均重復進行3次，以平均值±標準差表示。數據采用Excel 2010進行處理，使用SPSS 26進行方差分析，使用Origin 2018進行圖形繪制。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌在MRS-纖維二糖平板生長狀況

3株乳酸菌均可在以纖維二糖為碳源的MRS平板生長(圖1)，說明3株乳酸菌產生的β-葡萄糖苷酶均具有水解纖維二糖的能力。

a-L.plantarum C1；b-L.plantarum C5；c-E.durans GW18275圖1 乳酸菌于MRS-纖維二糖平板劃線生長狀況Fig.1 Growth of lactic acid bacteria on MRS-cellobiose plate

2.2 不同碳源誘導β-葡萄糖苷酶活力

分別研究了以葡萄糖、纖維二糖為碳源對乳酸菌產酶的影響。如圖2所示，纖維二糖為碳源誘導菌株產β-葡萄糖苷酶活力顯著高于葡萄糖為碳源時的β-葡萄糖苷酶活力(P<0.05)。葡萄糖為碳源時L.plantarumC5有最大β-葡萄糖苷酶活力3.74 U/mL，E.duransGW18275酶活力為2.49 U/mL，L.plantarumC1酶活力最小為2.37 U/mL。纖維二糖為碳源時，E.duransGW18275酶活力最大，為16.02 U/mL，L.plantarumC5酶活力為5.55 U/mL，L.plantarumC1酶活力為5.26 U/mL。纖維二糖誘導使乳酸菌產生的β-葡萄糖苷酶活力顯著升高，說明產生的β-葡萄糖苷酶為誘導酶。根據其底物特異性β-葡萄糖苷酶可分為3類：一類可以水解烴基β-葡萄糖苷和芳香基β-葡萄糖苷，一類只能水解烴基β-葡萄糖苷，還有一類只能水解芳香基團糖苷[15]。本研究的3株乳酸菌產的β-葡萄糖苷酶同時具有能水解烴基糖苷(纖維二糖)和芳香基糖苷(p-NPG)的能力，具有廣泛的底物特異性。

圖2 乳酸菌分別由葡萄糖和纖維二糖誘導的β-葡萄糖苷酶活力Fig.2 β-glucosidase activity induced by glucose or cellobiose of lactic acid bacteria注：*表示不同碳源之間的顯著性差異(P<0.05)，不同小寫字母表示不同菌種同一碳源間差異性顯著(P<0.05)

2.3 益生特性研究

2.3.1 溶血性

溶血性分3類：α-溶血特點是菌落周圍有草綠色溶血圈，對人致病力差；β-溶血特點是菌落周圍出現透明溶血圈，對人致病力強；γ-溶血即不溶血，菌落周圍培養基沒有變化[16]。ARGYRI等[16]發現大部分乳酸菌均不具有溶血性，只有少量乳酸菌具有對人體致病能力較低的α-溶血。本研究中3株乳酸菌于哥倫比亞血瓊脂平板上沒有溶血現象(圖3)，因此，菌株是非溶血性的。

a-L.plantarum C1；b-L.plantarum C5；c-E.durans GW18275圖3 菌株在哥倫比亞血瓊脂平板上的溶血性Fig.3 Hemolysis of strains on Columbia blood agar plates

2.3.2 抗生素敏感性

對抗生素的敏感性是評價益生菌安全性的標準之一。如表1所示，3株菌均對阿米卡星、阿奇霉素、頭孢拉定、四環素敏感。L.plantarumC1對頭孢他啶、卡那霉素、青霉素不敏感。L.plantarumC5對頭孢噻肟、頭孢他啶不敏感。而E.duransGW18275對頭孢噻肟、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和青霉素均不敏感。

表1 乳酸菌對不同抗生素的敏感性Table 1 Sensitivity of strains of lactic acid bacteria to different antibiotics

益生菌菌株對抗生素的敏感性有重要要求，因為益生菌菌株中存在的抗生素耐藥基因可能轉移到致病菌菌株中[17]。但也有研究認為抗生素耐藥性轉移的發生率非常低[18]。有研究表明乳酸菌菌株對β-內酰胺類、四環素類和大環內酯類抗生素敏感，但對氨基糖苷類抗生素耐藥[19]。本研究中3株乳酸菌對頭孢菌素類、β-酰胺類及氨基糖苷類抗生素有不同的藥敏性，對四環素敏感。許女等[20]對傳統發酵食品中分離的97株乳酸菌的抗生素耐藥性進行評估，發現乳酸菌對慶大霉素、卡那霉素和四環素的耐藥性較強，耐藥率達50%以上。L.plantarumC1和L.plantarumC5在抗生素藥敏性方面具有較好的安全性，而E.duransGW18274的耐藥性應引起重視，建議加強抗菌藥物的規范使用，減少耐藥菌株的使用和傳播[21]。

2.3.3 模擬胃腸液耐受性

益生菌必須通過胃的應激條件(低pH值1.5～3，持續3 h)才能達到腸道發揮益生作用[22]，3株乳酸菌在模擬胃腸液中的存活率如表2所示。3株乳酸菌在模擬胃液中的存活率均高于60%以上，其中，L.plantarumC1有最佳耐受模擬胃腸液能力，經模擬胃液處理3 h后活菌數為3.00×108CFU/mL，存活率為(88.24±7.20)%，且其在模擬腸液中存活率為(101.11±5.67)%，幾乎不影響其存活。L.plantarumC5經模擬胃液和腸液處理存活率分別為(79.25±13.19)%和(53.10±12.52)%，但活菌數均在108CFU/mL左右，在腸道內還能發揮益生菌的有益作用。E.duransGW18275在胃液中存活率為(62.96±13.86)%，在腸液處理中存活率(29.50±4.17)%。益生菌經胃腸道處理后活菌數至少達106CFU/mL才能產生有益作用[23]。而本研究中3株乳酸菌經過模擬胃腸液消化后活菌數均在106CFU/mL以上，具有較強的腸胃道耐受能力。

表2 乳酸菌在模擬胃腸液中的存活率Table 2 Survival rate of lactic acid bacteria in simulated gastroenteric fluid

2.3.4 膽鹽耐受性

對膽鹽的耐受性是細菌在宿主小腸中定植和代謝活動的先決條件，這有助于乳酸菌到達小腸和結腸，促進腸道菌群的平衡[24]。MULAW等[25]從發酵的埃塞俄比亞食品中分離的乳酸菌耐受3 g/L膽鹽的存活率為24.30%～97.22%。本研究中L.plantarumC1、L.plantarumC5、E.duransGW18275均有良好的生存能力，存活率分別為(71.53±8.73)%、(83.70±6.21)%和(70.59±8.66)%，說明其具有良好的耐受膽鹽的能力。

2.3.5 自聚集率

自聚集是生物膜形成的一個重要特性, 乳酸菌生物膜通過保護胃腸道轉運中的菌株，產生抗菌化合物和刺激免疫應答從而進行腸道定植[13]。3株乳酸菌的自聚集率如表3所示。所有乳酸菌菌懸液在37 ℃下放置4 h，自聚集率在18%～25%，在37 ℃放置24 h，自聚集率在50%～81%。L.plantarumC1在24 h時具有最高的自聚集率(80.72±1.58)%，其次為L.plantarumC5 (63.92±0.66)%，E.duransGW18275自聚集率最低。SHEKH等[13]測定的10株菌中，2株鼠李糖乳桿菌孵育2 h的自聚集率分別為14%和30%，其余8株植物乳桿菌孵育2 h的自聚集率在3%～20%，并且隨著孵育時間的增加，自聚集率會明顯增加，與本文研究結果一致，本試驗中3株乳酸菌有較強的自聚集率，具有可促進形成胃腸道防御屏障的潛能。

表3 乳酸菌的自聚集率Table 3 Auto-aggregation rate of lactic acid bacteria

2.3.6 疏水性

細菌表面疏水性是指細菌在極性水中所呈現的不穩定狀態，從而引起一系列菌體的重新分布及排列的變化，疏水性被認為與多種黏附現象有關，益生菌發揮益生功效的關鍵在于其能夠黏附于宿主腸道黏膜細胞表面[26-27]。不同細菌、同種細菌不同菌株與有機相吸附的能力并不相同，菌株表面結構不同會導致表面疏水性的差異[28]。菌株疏水性結果如表5所示。L.plantarumC1和L.plantarumC5對乙酸乙酯有最佳疏水性[(56.50±1.30)%和(56.50±1.30)%]，何杉杉等[29]對8株乳酸菌疏水性進行評價發現菌株對乙酸乙酯的疏水性均較高，對正己烷的疏水性處于較低水平。在本研究中，E.duransGW18275對正己烷的疏水率較弱為(8.81±1.24)%，而對二甲苯和乙酸乙酯的疏水性略高，這與文獻報道的腸球菌一般不具有較高的疏水性結果一致[30]，說明該堅強腸球菌的非特異性黏附能力不強。

表4 乳酸菌細胞表面疏水性Table 4 Cell surface hydrophobicity of lactic acid bacteria

3 結果與討論

本研究使用的3株乳酸菌均能產生水解烴基β-葡萄糖苷和芳香基β-葡萄糖苷的β-葡萄糖苷酶，具有廣泛的底物特異性。通過纖維二糖對3株乳酸菌進行誘導可顯著提高其產生的β-葡萄糖苷酶活力，E.duransGW18275在纖維二糖誘導時具有最大酶活力(16.02 U/mL)。3株乳酸菌可用于糖苷類生物活性物質的脫糖基轉化以提高生物利用度，以及用于酶解增香等食品領域。此外，3株乳酸菌顯示出主要的益生菌特性，包括對胃腸道消化及膽鹽的耐受能力，較好的自聚集及疏水性，可為日后開發同時具有生物活性物質和益生功效的混合益生制劑提供理論依據，在功能食品等領域具有潛在的應用價值。