互助縣牦牛呼吸道疾病病原的分離鑒定

殷 林

青海省海東市互助縣畜牧獸醫(yī)站，青海海東 810500

近年隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖數(shù)量大幅度的增加，牛病的發(fā)生也越來越多且越來越復雜[1]。其中牛呼吸道疾病綜合征由多種病原所引起，包括BPIV-3、IBRV、BVDV或化膿性隱秘桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌等其他細菌所引起的一種會使牛發(fā)生一系列呼吸道反應的疾病。患有呼吸道疾病的病牛在臨床上會顯示出肺部的感染，尤其是病毒對呼吸系統(tǒng)會造成很大的傷害，引起呼吸系統(tǒng)疾病。感染病毒后會出現(xiàn)呼吸困難，并且有一定程度的呼吸障礙，吃食無力等癥狀。牛在排泄時會觀察到糞便不成型、水樣便，最終牛會出現(xiàn)四肢無力的癥狀，嚴重者會導致死亡。急性感染的情況下，發(fā)病時間短，并且在15 d內(nèi)快速的死亡，剖檢急性感染死亡的病牛會出現(xiàn)肺臟腫大、肺臟與胸膜黏連、胸腔積液的癥狀，并且有一部分發(fā)病嚴重的病死牛會出現(xiàn)肺臟纖維化，出現(xiàn)白色泡沫的癥狀。該類疾病主要引起牛高熱、精神不佳、呼吸困難、流鼻涕、咳嗽等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[2，3]。本試驗通過對互助縣某牛場暴發(fā)的牦牛呼吸道疾病綜合征進行PCR鑒定，確定牦牛感染的病原體，更好的為牛病的防控奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病料

2021年1月，青海互助縣某牦牛養(yǎng)殖場內(nèi)最近出現(xiàn)部分牦牛有高熱、消瘦、咳嗽、呼吸障礙等癥狀，選取6頭呼吸道癥狀明顯的牦牛采取其鼻液進行試驗。

1.2 采樣

用無菌鼻拭子采集6頭牛的鼻液，并于鼻拭子采樣器中添加細胞保持液。將樣本做好標記，分別標 記 為HZ-1，HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5，HZ-6。保存于4 ℃環(huán)境內(nèi)盡快進行檢測。

1.3 試驗材料

1 000 μL吸頭、200 μL吸頭、10 μL吸頭、無菌離心管1.5 mL、無RNA酶離心管1.5 mL、天根鼻拭子DNA提取試劑盒、天根鼻拭子RNA提取試劑盒，life反轉(zhuǎn)率試劑盒，Ex-Tap Mix購自大連寶生物。

1.4 引物合成

BPIV-3、IBRV、BVDV、化膿性隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌的引物參照吳翠蘭發(fā)表的文章[4]，由華大基因公司進行合成。

1.5 病料的PCR鑒定

RNA/DNA樣本提取根據(jù)天根提取試劑盒說明書進行操作，RNA樣本要使用life反轉(zhuǎn)率試劑盒將cDNA轉(zhuǎn)錄為DNA，PCR程序按照吳翠蘭等發(fā)表的文章[4]進行設置，PCR體系為50 μL，反應體系如表1。反應結束后進行1.5的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠電泳成像儀下觀察試驗結果。

表1 PCR反應表

2 結果

進行PCR試驗后結果顯示檢測BPIV-3、IBRV均為陰性，檢測BVDV結果顯示HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5為陽性，化膿性隱秘桿菌檢測結果顯示HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5為陽性，HZ-1，HZ-6均為陰性。

3 討論

牛呼吸道疾病綜合征對養(yǎng)牛業(yè)影響十分巨大，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國不同地區(qū)均有牛呼吸道疾病綜合征的發(fā)生。2014年郭利等[5]建立了牛呼吸道疾病綜合征相多重PCR檢測方法，可以同時進行BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV四種病毒的檢測，并對四個省份的樣本進行了檢測，檢測結果顯示多為多重病毒感染。2017年曹禺[6]等對內(nèi)蒙古某地區(qū)的牛呼吸系統(tǒng)疾病進行了分離和鑒定，結果顯示主要引起呼吸道疾病的病原為牛呼吸道合胞體病毒和支原體。2019年張穎慧等[7]對四川省11個暴發(fā)牛呼吸道綜合征的肉牛場進行了多病原的檢測，檢測結果顯示共檢測出9種病原，以IBRV、牛分支桿菌和溶血性曼氏桿菌較為多見，且較多呈混合感染。2020年6月至2021年1月，孫凌煒[8]對我國北方部分地區(qū)和牧場進行樣本收集，進行了引起牛呼吸道綜合征主要病原流行病學調(diào)查，結果顯示檢測到多種不同的病原，各種病原檢測陽性率在0.75%～19%之間，且存在不同種病原的混合感染。本試驗的結果顯示互助縣某牦牛養(yǎng)殖場檢測的樣本中含有BVDV和化膿性隱秘桿菌，6例樣本中有4例含BVDV，4例含化膿性隱秘桿菌,且均為混合感染，其他2例為陰性樣本，本次檢測未檢測到BPIV-3、IBRV、多殺巴氏桿菌，對于互助縣牦牛呼吸道疾病仍需要加強監(jiān)控。

近年，我國奶牛和肉牛發(fā)展非常迅速，牦牛養(yǎng)殖業(yè)也不斷地擴大，且隨著國家對于西北經(jīng)濟發(fā)展的大力支持和重視，西北地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展得到了很高的提升。牛呼吸道綜合征對養(yǎng)殖業(yè)的影響十分嚴重，造成了很大的經(jīng)濟損失，且多以混合感染為主，治療難度大。隨著畜牧獸醫(yī)科技發(fā)展，對于多種病原的檢測可采取多重PCR，real-timePCR等先進的技術手段進行檢查[9]，更快更精準的了解病原，為牛呼吸道綜合征的有效防控提供依據(jù)。我國動物防疫一直采取“預防為主”的政策，政府對于重大的動物疫病進行強制免疫，有效的控制了很多動物疾病的發(fā)生。我國對于牛呼吸道綜合征的研究已經(jīng)十分廣泛，了解牛呼吸道綜合征的病原可以更好的進行疾病防控，對于疾病的防控有了很大的幫助，預防疾病要進行有針對性的疫苗防控，幫助建立特異性的免疫力，雖然我國對于該類疾病的研究已經(jīng)有了很大的進步，但是也相對于國外有所差距，在這方面的研究，我國獸醫(yī)科研人員仍需加大努力，更好的為養(yǎng)殖業(yè)服務。

此外，豐富農(nóng)牧民對高原牦牛呼吸系統(tǒng)疾病的認知，加強健康宣教，使農(nóng)牧民充分了解呼吸系統(tǒng)疾病對高原牦牛健康及養(yǎng)殖業(yè)造成的危害，能夠充分認識加強呼吸系統(tǒng)疾病防治工作的重要性和必要性。相關部門應該加大對牦牛呼吸系統(tǒng)疾病的宣傳力度，可通過建立宣傳網(wǎng)站、短信發(fā)送、微信推送、廣播及視頻等形式，豐富廣大農(nóng)牧民對呼吸系統(tǒng)疾病病理知識、危害以及防治措施等知識的認知，激發(fā)和調(diào)動廣大農(nóng)牧民的疾病預防積極性和主動性。

4 小結

牦牛為高原地區(qū)農(nóng)牧民常見養(yǎng)殖牲畜，對于提高農(nóng)牧民經(jīng)濟收入以及推動高原地區(qū)畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展均可發(fā)揮非常重要的作用。高原地區(qū)溫度較低且氣候多變，雖然牦牛具有較強的御寒能力，但是溫度突變?nèi)菀自斐申笈．a(chǎn)生應激反應并誘發(fā)感冒等常見呼吸系統(tǒng)疾病，對牦牛的健康生長發(fā)育等均會造成不良影響。為了提高牦牛的生產(chǎn)效率及廣大農(nóng)牧民的經(jīng)濟效益，必須采取科學合理的防治措施以有效控制呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展。此外，互助地區(qū)某牦牛養(yǎng)殖場感染的牛呼吸道綜合征主要以BVDV和化膿性隱秘感染混合感染為主，需要養(yǎng)殖場加強免疫管理，且對于細菌性疾病要精準用藥，避免出現(xiàn)耐藥性，在臨床中要進行合理的用藥，相信通過大家科學的飼養(yǎng)，高效的疾病防控能力，可以更好地增加經(jīng)濟效益，為互助縣的牦牛養(yǎng)殖業(yè)做出貢獻。