超聲前處理對大豆分離蛋白水解度的影響

文超婷，張繼賢*，段玉清

1. 揚州大學食品科學與工程學院（揚州 225127）；2. 江蘇大學食品科學與工程學院（鎮江 212013）

脫脂大豆粕是大豆提油后剩下的副產物，產量非常大，常用于飼養動物或以廢物處理。大豆粕中含有高比例的蛋白質和優質氨基酸[1]。此外，一些研究表明大豆分離蛋白水解物還具有較好的生物活性[2-3]。大部分研究表明酶解法被普遍用于制備生物活性肽，然而，酶解法存在反應時間長、蛋白轉化率低和成本高等缺點[4]。超聲是一種新型、綠色、環保的方法，它能夠彌補酶解法的不足。大量文獻表明，超聲波處理能夠顯著提高多肽的制備效率和改善生物活性[5-6]。然而，有關超聲輔助酶解制備西瓜籽多肽的研究卻未見報道。

因此，試驗通過響應面分析，研究超聲時間、超聲功率、蛋白濃度和酶解溫度對大豆分離蛋白水解度的影響，為超聲前處理輔助蛋白酶解工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（山東西亞化工有限公司）；堿性蛋白酶（諾維信生物技術有限公司）；NaOH、濃鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

DL-5C離心機（上海安亭有限公司）；DHG-9920A電熱鼓風干燥箱（上海恒科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海理達儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 超聲預處理酶解反應

將大豆分離蛋白粉配制成一定濃度的溶液，對蛋白溶液進行超聲前處理。根據Wen等[7]的酶解方法，加入0.1 mol/L NaOH將蛋白溶液調至pH 9.0，加酶量為蛋白粉質量的1%，在50 ℃恒溫水浴中酶解4 h。結束后加入0.1 mol/L NaOH溶液，調解至反應初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量。

1.3.2 水解度的測定

酶解過程中水解度的測定采用pH-start[8]法，計算公式見式（1）。

式中：V為酶解過程中所消耗的NaOH溶液體積，mL；n為NaOH溶液的濃度，mol/L；α為α-NH3平均解離度；m為樣品中蛋白質質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 超聲前處理時間對蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、底物濃度3.5 g/L、溫度50 ℃條件下，超聲前處理時間分別為10，20，30，40和50 min，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調解至反應初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對水解度進行計算。

1.3.3.2 超聲功率對蛋白水解度的影響

在底物濃度3.5 g/L、溫度50 ℃和超聲前處理時間30 min的條件下，超聲前功率分別為100，150，200，250和300 W，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調解至反應初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對水解度進行計算。

1.3.3.3 底物濃度對蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、溫度50 ℃和超聲前處理時間30 min的條件下，底物濃度分別為2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 g/L，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調解至反應初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對水解度進行計算。

1.3.3.4 溫度對蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、底物濃度3.5 g/L和超聲前處理時間30 min的條件下，溫度分別為30，40，50，60和70 ℃，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調解至反應初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對水解度進行計算。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定各因素的最佳水平范圍，采用響應面中心組合試驗設計，研究各參數對考察指標的影響規律，并得到最佳添加量條件。以超聲前處理時間（A）、超聲功率（B）、底物濃度（C）、溫度（D）為自變量，以水解度為響應值，其因素水平編碼見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因子水平及編碼

1.3.5 數據處理采用SPSS 19.0數據分析軟件進行變化顯著性分析。使用Origin 2011軟件對數據進行統計分析并繪制圖表，使用Design Expert 8.0.6進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲前處理時間對蛋白水解度的影響

水解度能夠反映蛋白酶解的程度。由圖1可知，隨著超聲前處理時間的增加，蛋白水解度呈現先增加后下降的趨勢，這表明適宜的超聲前處理能夠促進大豆分離蛋白的酶解程度。這種現象可能是由于超聲波能夠改變蛋白質的結構，暴露更多的酶切位點[9]。試驗結果與Uluko等[12]報道的結果相一致，超聲前處理能夠顯著提高牛奶蛋白的水解度。然而，當時間超過30 min后水解度呈現下降趨勢，這主要是由于過長的時間會導致蛋白分子發生再聚集，不利于酶解反應的進行[10]。因此，選擇超聲前處理20，30和40 min用于后續試驗優化。

圖1 不同前處理時間對水解度的影響

2.1.2 超聲功率對蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著超聲功率的增加，蛋白水解度呈現先增加后下降的趨勢，在功率為200 W時到達最大值，這表明超聲在適宜的功率范圍內，能夠顯著促進蛋白的酶解。隨著超聲功率的增加，水解程度的增加可歸因于超聲空化效應的增強，這是由于時間的推移，會產生更多的空化活性體積[11]。

圖2 不同功率對水解度的影響

2.1.3 底物濃度對蛋白水解度的影響

從圖3中可以看出，隨著底物濃度的增加，蛋白水解度先增加后減少，在底物濃度4 g/L時達到最大值。底物濃度超過4 g/L時，蛋白水解度有所下降。考慮到盡可能少地使用原料，實現更多的酶解，選取3.0，3.5和4.0 g/L用于后續響應面優化試驗。

圖3 不同底物濃度對水解度的影響

2.1.4 溫度對蛋白水解度的影響

不同溫度對大豆分離蛋白水解度的影響如圖4所示。隨著溫度的增加，水解度呈現逐漸上升的趨勢，這可能是由于超聲和熱能夠加速蛋白結構的改變，增加蛋白內部分子展開的速率，加速酶與底物的反應效率[12]。然而，溫度超過50 ℃后水解度呈現下降的趨勢，這可能是由于過高的溫度會引起蛋白分子的聚集，阻礙酶解反應的進行[13]。因此，選擇40，50和60℃用于后續響應面優化。

圖4 不同溫度對水解度的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 模型建立與數據分析

基于單因素試驗分析，根據Box-Behnken中心組合設計四因素三水平的響應面分析試驗，試驗方案根據表2的因素與水平設計，所得回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果

得到以水解度（Y）為響應值的四元二次回歸方程：水解度（Y）=11.02-0.33A-0.16B+1.43C+0.25D+1.70AB-0.82AC+0.54AD+1.07BC-0.95BD-0.035CD-0.36A2-1.34B2+0.36C2-0.47D2。回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，所建立的水解度回歸模型P=0.000 1，達到極顯著水平，得出R2=0.995 3，失擬項（P=0.396 3）不顯著，說明回歸模型和預測值之間有較好擬合度。模型的一次項A、B、C、D（P＜0.01）影響極顯著；二次項A2、B2、C2（P＜0.01）影響均極顯著；交互項CD（P＞0.05）影響不顯著，AB、AC、AD、BC、BD（P＜0.01）影響極顯著。由此可知，4個因素對水解度影響的順序為C＞A＞D＞B，即底物濃度＞時間＞溫度＞功率。

表3 回歸模型及顯著性檢驗（水解度）

2.2.2 驗證試驗

軟件給出的最優工藝參數為超聲時間20 min、超聲功率188.67 W、底物濃度4.0 g/L和酶解溫度59.55℃，此時水解度為13.73%。選取超聲時間20 min、功率190 W、樣品濃度4 g/L、酶解溫度60 ℃進行試驗驗證，水解度為13.61%±0.21%，接近預測值13.73%，工藝參數與軟件給出預測值較吻合。因此，可作為最優工藝參數。

3 結論

通過單因素試驗，確定超聲前處理時間、超聲功率、底物濃度、溫度各因素在單一因素變化的情況下的最優值。以單因素試驗的結果為基礎，用響應面法對蛋白水解度進行優化，建立超聲前處理時間、超聲功率、底物濃度和酶解溫度對水解度的二次回歸方程模型。經驗證，該數學模型可靠，可用于水解度優化參數的預測。結合單因素試驗、響應面試驗和驗證試驗，確定水解度最優超聲前處理參數：超聲時間20 min、超聲功率190 W、蛋白濃度4 g/L和酶解溫度60 ℃。在此最優工藝參數下大豆分離蛋白水解度為13.61%±0.21%。