同時測定醬油中4種甜味劑LC-MS/MS法的建立

雷軍

綿陽師范學院化學與化學工程學院（綿陽 621000）

醬油是我國傳統的調味品，因其獨特的風味、色澤及豐富的營養價值，已成為我國、日韓、東南亞各國乃至歐美人民飲食生活中不可或缺的調味品[1]。甜菊糖苷和甜菊雙糖苷是一類來源于甜葉菊葉片的四環二萜類糖苷物質，被稱為繼甘蔗、甜菜之后，第三類健康綠色糖源[2-3]。甘草酸和甘草次酸等三萜類化合物是甘草的主要成分，也是甘草甜味的主要來源[4]。近年來，在醬油中陸續檢出甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸等物質。這類物質加入醬油中，可抑制鹽味和苦味，增加醬油的風味[5]。但是甜菊糖苷加入醬油中有限量要求、甜菊雙糖苷和甘草次酸并未進入食品添加劑管理[6]，若在加工過程中為了改善醬油口感超限量、超范圍添加此類物質，對人身體有一定的損害。目前，檢測其中一種或兩種成分的方法有薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、液質聯用法[9]，同時檢測這4種組分的方法只有高效液相色譜法[10]，這種方法存在靈敏度不高、假陽性以及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷色譜峰未完全分開的問題[10]，導致無法對這4種物質準確定性及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準確定量。

針對以上問題，試驗建立了同時測定醬油中的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MS/MS法。在提高此類物質定性能力的同時可以實現甜菊糖苷、甜菊雙糖苷完全分離并實現甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙酸乙酯（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；無水硫酸鎂（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；C18粉末（批號：W103678，納譜分析技術有限公司）；甜菊糖苷標準品（天津阿爾塔科技有限公司CAS：57817-89-7 99.7%）、甜菊雙糖苷標準品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：41093-60-1 99.8%）、甘草酸標準品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：1405-86-3 80.6%）、甘草次酸標準品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：471-53-4 99.9%）。

1.2 主要儀器與設備

DGU20A-API4500高效液相色譜-串聯質譜儀（美國AB SCIEX公司）；FA124型電子天平（上海市舜宇恒平科學儀器有限公司）；TGL-16型臺式高速離心機（四川蜀科儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫培養振蕩器（常州冠軍儀器制造有限公司）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZH-2型旋渦儀（天津藥典標準儀器廠）。

1.3 色譜條件

液相色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C184.6 mm×150 mm 3.5 μm；進樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相：A：甲醇；B：0.1%甲酸。

1.4 質譜條件

DGU20A-API4500液相色譜串聯質譜儀，質譜參數：ESI正負離子同時掃描。離子源溫度：400 ℃；離子源電壓：4 500 V；CUR：20 psi；CAD：5 psi；GS1：30 psi；GS2：30 psi；多反應監測參數如表2所示。

表1 梯度洗脫

表2 多反應監測

1.5 標準曲線的配制

1.5.1 4種甜味劑準儲備液的制備

精確稱取10 mg甜菊糖苷標準品、甜菊雙糖苷標準品、甘草酸標準品、甘草次酸標準品至4個10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，此溶液4種甜味劑的質量濃度為1 mg/mL，冷藏保存。

1.5.2 4種甜味劑標準混合中間液的制備

準確移取甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標準儲備液各0.01 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，此混合溶液中4種甜味劑的質量濃度為1 μg/mL。

1.5.3 4種甜味劑混合基質標準工作溶液的制備

分別稱取6份空白醬油樣品各2.0 g（精確至0.01 g）置于25 mL離心管中，準確移取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標準混合中間液，按照1.6小節進行提取和凈化，配成質量濃度為0，4，8，16，24，32和40 ng/mL的混合基質標準工作液。

1.6 供試品溶液的制備

1.6.1 提取

稱取2.0 g（精確至0.01 g）混勻后的醬油試樣置于25 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇、4 g無水硫酸鎂、2 g C18粉末，旋渦1 min，振蕩提取10 min，超聲提取10 min，按10 000 r/min離心5 min，取上清液置于另一25 mL塑料離心管，重復上述步驟，合并兩次上清液，用甲醇定容至25 mL，待凈化。

1.6.2 凈化

取1 mL上述待凈化溶液至于10 mL塑料離心管中，加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg C18粉末，渦旋混合2 min，按10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機相微孔濾膜，濾液供上機分析。

1.7 提取溶劑的選擇

根據4種甜味劑的特性，試驗依此選擇水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯為提取溶劑，以質量分數均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質控樣，按照1.6小節供試液的制備步驟，比較測得的含量。

1.8 提取次數的選擇

采用1.7小節確定的提取溶劑，按照1.6.1小節的提取步驟，以質量分數均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質控樣，提取1，2，3和4次，其余步驟同1.6小節，比較測得的含量。

1.9 監測模式的選擇

將4種甜味劑標準混合中間液注入液質聯用儀，分別記錄這4種物質的一級質譜圖，分別選取特異性強的監測模式作為試驗中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的監測模式。

1.10 方法的準確性

稱取9份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管，3份為一組，分別加入0.1，0.4和0.8 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標準中間溶液，按照1.6小節供試品溶液制備方法操作，配制成為50，200和400 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質控樣。

1.11 精密度試驗

稱取6份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管，按照1.6小節樣品制備方法，配制成質量分數為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質控樣。將上述6份溶液注入液相色譜-質譜/質譜儀，測得甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的峰面積，分別代入各自基質標準曲線，計算濃度及SRSD值，即得精密度結果。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

由表3可知，4種甜味劑在0～40 ng/mL的質量濃度范圍內R均＞0.99。表明這4種甜味劑在0～40 ng/mL范圍內線性良好。故選用0～40 ng/mL為試驗的線性范圍。

表3 4種甜味劑的標準曲線

2.2 提取溶劑的選擇

由圖1可知，甘草次酸在水溶液中溶解度較小，甘草酸在乙醇中難溶，除了甘草次酸，其余三種化合物在乙酸乙酯中的溶解度均較小。這四種化合物在甲醇中均有很好的溶解性。可能的原因是上述溶劑的極性不同，化合物按照“相似相溶”原則，在每種溶液中溶解度不同。綜上，選擇甲醇為試驗的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的考察

2.3 提取次數的選擇

由圖2可知，這四種化合物在僅提取一次的情況下，測得值均在80 μg/kg左右，不能提取完全，提取2次以上的測得值明顯高于僅提取一次的測得值，且隨著提取次數的增加，測得值無明顯提升，考慮到操作的簡便性、經濟性以及環保等因素，試驗選擇提取2次。

圖2 不同提取次數的考察

2.4 監測模式的選擇

由圖3～圖4可知：4種甜味劑在負模式下均有響應，甘草酸在正模式下沒有響應；甜菊糖苷和甜菊雙糖苷在正模式下以加鈉峰的形式出現。由圖5～圖6可知：甜菊糖苷在負模式下同時出現803.5和641.4兩個分子離子峰，嚴重干擾甜菊雙糖苷的分子離子峰，這與朱靜雯等[11]研究結果相同。為避免干擾，甜菊糖苷、甜菊雙糖苷選取正模式的監測模式；甘草酸、甘草次酸選擇負模式的監測模式。

圖3 4種物質負模式下的一級質譜圖

圖4 4種物質正模式下的一級質譜圖

圖5 甜菊糖苷負模式下的一級質譜圖

圖6 甜菊糖苷負模式下的一級質譜圖

2.5 方法的準確性

由表4可知，甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸在50，200和400 μg/kg回收率依次在90.5%～94.9%，87.7%～94.6%，86.9%～97.3%和87.1%～96.5%之間，滿足試驗要求。

表4 不同濃度下4種甜味劑回收率結果

2.6 方法的精密度

由表5可知，4種甜味劑用相對標準偏差SRSD表示，SRSD＜5%。表明此方法的精密度良好，符合要求。

表5 4種甜味劑精密度結果（n=6）

3 結論

試驗建立了同時測定醬油中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MSMS法，優化了試驗的提取溶劑及次數，考察了方法的線性方程、監測模式、專屬性、檢出限、定量限、方法回收率以及精密度。該方法的監測模式為甜菊糖苷、甜菊雙糖苷正模式；甘草酸、甘草次酸為負模式。該方法具有操作簡單、定性能力強、靈敏度高等特點，解決了現有液相方法定性能力不強、甜菊糖苷和甜菊雙糖苷因無法完全分開導致的定量不準確的問題。