冠心病病人外周血單個核細胞AIM2表達水平及其與炎性因子的相關性

王玉燕，鐵虎光，金麗山，馬萬程

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，隨著飲食結構的改變及生活水平的不斷進步，該病發病率和死亡率呈增加趨勢，引發的心源性死亡等嚴重不良預后成為重大的公共問題[1]。冠心病主要包括穩定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)、不穩定型心絞痛(unstable angina pectoris，UAP)、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，冠心病是一種慢性炎癥性疾病，與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等炎性因子均有密切聯系[2-3]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)是位于細胞質中的一種蛋白質，可間接誘導炎癥體組裝，進而在炎癥反應中發揮著重要作用[4]。本研究旨在分析SAP、UAP、AMI病人外周血單個核細胞AIM2表達水平及其與血漿炎性因子的相關性，以期進一步明確冠心病的發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月—2020年5月于我院住院治療的221例冠心病病人，將冠心病病人分為SAP組(69例)、UAP組(74例)和AMI組(78例)；同期選取健康體檢者79名作為對照組。

1.2 納入與排除標準 納入標準：AMI符合急性ST段抬高型心肌梗死診斷及治療指南[5]，SAP符合慢性穩定型心絞痛診斷與治療指南中的診斷標準[6]，UAP符合相關診斷標準[7]；病人病例資料齊全；符合倫理學標準，所有研究對象均為自愿參與本研究；近1個月內無手術治療史。排除標準：伴有感染性疾病、惡性腫瘤；伴有原發性心肌病或嚴重肝、腎功能不全；6個月內發生過腦卒中及急性腦血管疾病；伴有其他血液系統及自身免疫疾病；近1周內使用免疫抑制劑、抗炎藥物。

1.3 觀察指標 查閱門診及住院病歷，收集病人入院時臨床資料，包括性別、年齡、體質指數(body mass index，BMI)、吸煙史、高血壓、糖尿病、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血糖水平。

1.4 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號：YT9197)、反轉錄試劑盒(貨號：YT9036)購自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR?Green Master Mix(貨號：11202ES)購自上海翊圣生物科技有限公司；TNF-α酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號：ABE10038)、IL-1 ELISA試劑盒(貨號：ABE10470)、IL-8 ELISA試劑盒(貨號：ABE10308)均購自上海瓦蘭生物科技有限公司；IL-6 ELISA試劑盒(貨號：SEKH-0013)購自北京索萊寶科技有限公司；MCP-1 ELISA試劑盒(貨號：FT-P31471R)購自上海梵態生物科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)儀(型號：7500)購自美國ABI公司；酶標儀(型號：INSTSUN-1)購自瑞士Tecan公司。

1.5 研究方法

1.5.1 樣品采集及保存 抽取所有研究對象清晨空腹外周靜脈血樣置于離心管中，加同等體積生理鹽水；將混勻的血樣加入含有人外周血淋巴細胞分離液的離心管中；將上述樣品以3 000 r/min離心30 min后取出，此時離心管最上層為血漿(收集血漿待測)，血漿層下的一白色薄層為外周血單個核細胞層；收集單個核細胞層，2 000 r/min離心5 min后取出，棄上清液，收集乳白色細胞；EP管中加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)吹懸數次，以2 000 r/min離心5 min后取出，棄上清液，重復2次或3次。

1.5.2 外周血單個核細胞AIM2水平測定 采用試劑盒提取外周血單個核細胞總RNA后反轉錄得cDNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用RT-qPCR儀擴增AIM2及內參GAPDH。AIM2及內參GAPDH的引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。反應體系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，SYBR?Green Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。設3個重復孔，采用2-△△CT法計算外周血單個核細胞AIM2 mRNA相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列(5′-3′)

1.5.3 血漿炎性因子水平檢測 采用ELISA檢測血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 4組臨床資料比較 對照組、SAP組、UAP組、AMI組性別、年齡、BMI、吸煙史比例、高血壓比例、糖尿病比例、TC、LDL-C、TG、血糖水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；HDL-C水平比較，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見表2。

表2 4組臨床資料比較

2.2 4組外周血單個核細胞AIM2 mRNA水平比較 對照組、SAP組、UAP組、AMI組外周血單個核細胞AIM2 mRNA水平依次上升，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖1。

表3 4組外周血單個核細胞AIM2 mRNA水平比較(±s)

圖1 4組外周血單個核細胞AIM2 mRNA水平比較

2.3 4組血漿炎性因子水平比較 對照組、SAP組、UAP組、AMI組血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均依次上升，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 4組血漿炎性因子水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.4 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示：冠心病病人AIM2 mRNA水平與TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1均呈正相關(P<0.05)。詳見表5。

表5 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關性分析

2.5 影響冠心病發生的多因素Logistic回歸分析 將是否發生冠心病作為因變量，以AIM2、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、HDL-C作為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示：AIM2是冠心病發生的獨立危險因素(P<0.01)，HDL-C是冠心病發生的保護因素(P<0.01)。詳見表6。

表6 影響冠心病發生的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

動脈粥樣硬化的發病機制包括脂質浸潤學說、氧化刺激學說、損傷應答學說、免疫炎癥學說等，其中免疫和炎癥與動脈粥樣硬化密切相關[8]。冠心病病人病變局部有炎性細胞浸潤，且體內炎性因子水平與心血管事件發生有關[9]。冠心病不良預后發生率極高，給家庭帶來沉重的經濟和醫療負擔，同時影響病人生活質量和生命健康[10]。因此，分析冠心病病人體內炎癥反應相關的生物指標，可能為進一步探討冠心病發生發展提供理論基礎，為治療提供新思路。

目前研究證實TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等炎性因子與冠心病密切相關，其中TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞合成，是體內重要的炎癥介質，在炎癥反應及免疫調節中均可發揮生物學功能，觸發冠心病發生、發展[11]；IL-1通過促進B細胞增殖及抗體分泌，發揮免疫調節作用，可間接參與動脈粥樣硬化的形成[12]；IL-6參與炎癥反應，在炎癥早期、局限性炎癥及機體出現應激反應等多種因素中有不同程度升高[13]；IL-8在巨噬細胞和單核細胞合成，其他細胞可少量產生[14]；MCP-1是趨化因子CC家族成員，可與趨化因子受體結合，從而在動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應中發揮作用[15]。本研究通過檢測SAP、UAP、AMI病人血漿炎性因子，結果顯示TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于健康人群，且AMI病人血漿炎性因子水平最高，與史麗紅等[16-17]研究結果一致。AIM2可識別細胞質雙鏈DNA，并與其結合形成炎性復合體，之后通過與熱蛋白結構域相互作用招募接頭蛋白，進而調節炎性因子表達[18]。張席軍等[19]研究表明，乙型肝炎病毒相關性腎炎病人AIM2表達水平升高，且與IL-1β等多種炎性因子存在密切聯系。本研究結果顯示，健康人群、SAP病人、UAP病人、AMI病人外周血單個核細胞AIM2 mRNA水平依次上升，且AIM2是冠心病發生的影響因素。提示AIM2高表達可能與冠心病發生、發展有密切聯系。進一步研究顯示，冠心病病人體內AIM2 mRNA表達水平與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關。推測冠心病病人AIM2表達水平升高后，可感知并結合胞質雙鏈DNA，形成復合體后促進TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子成熟和分泌。

綜上所述，SAP、UAP、AMI的冠心病病人外周血單個核細胞中AIM2呈高表達，且與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關。AIM2可能通過促進炎性因子表達，參與冠心病發生發展，推測其可能成為冠心病潛在的治療靶點。臨床應密切監測冠心病病人AIM2及TNF-α、IL-1等炎性因子水平變化，及時制定合理有效的治療措施。今后需通過體外或體內干預AIM2表達，如建立AIM2基因敲除小鼠模型驗證本研究結論。