血管內皮聚集受體-1 rs12041331位點多態性對初發腦梗死病人認知功能的影響

郭宏偉，胡義奎，劉濤生，譚龍君，劉迪龑，馮 瓊

腦卒中后認知功能障礙是指腦卒中后6個月內出現的各種類型和程度的認知功能障礙，其危險因素包括腦卒中反復發作、高齡及受教育程度低等[1]。有研究表明， 血小板內皮聚集受體-1(PEAR1)基因(rs12041331)純合突變不僅影響抗血小板藥物療效，并且與腦卒中反復發作有關[2]。為排除腦卒中反復發作對病人認知功能損害的影響，本研究選取初發腦梗死病人為研究對象，旨在分析PEAR1 基因(rs12041331)純合突變與認知功能障礙的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月—2020年1月在武漢市武昌醫院神經內科門診或住院治療的初發腦梗死病人150例。所有病人均符合第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準[3]，且經我院顱腦計算機斷層掃描或磁共振成像檢查確診為腦梗死。排除標準：短暫性腦缺血發作、小卒中病人；嚴重精神障礙或嚴重器官功能衰竭病人。所有病人均自愿參與本研究并簽署知情同意書。本研究得到武漢市武昌醫院倫理道德委員會的批準。根據發病后6個月內7次(入組時及每個月1次)簡易智力狀態檢查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)評分[4]最高分將病人分為認知功能正常組(112例)和認知功能障礙組(38例)。

1.2 觀察指標

1.2.1 臨床資料 記錄病人臨床資料。測量身高和體重并計算體質指數。高血壓：收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mmHg，或既往曾診斷為高血壓，或正服用降壓藥物治療的病人。糖尿?。嚎崭寡?FPG)≥7.0 mmol/L或/和糖耐量試驗測定餐后2 h血糖(2 hPBG)≥11.1 mmol/L，或正在接受降糖治療的病人。吸煙：幾乎每日吸煙，且每日平均吸煙≥1支，持續時間>1年。飲酒：幾乎每日飲酒，且每日飲酒≥50 g，持續時間>1年。高齡：年齡>75歲。低教育程度：中學以下文化程度或未接受過任何教育。統計兩組入院時美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分[5]，評分越高提示病人神經功能缺損越嚴重。

1.2.2 PEAR1基因(rs12041331)單核苷酸多態性測定 所有病人入組后次日清晨抽取空腹肘靜脈血3 mL，使用乙二胺四乙酸(EDTA)管抗凝處理，保存于-20 ℃冰箱中，按照DNA提取試劑盒(Tiangen)說明書進行規范操作提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。采用聚合酶鏈反應(PCR)-限制性酶切片段長度多態性技術(RFLP)及直接PCR測序法檢測基因型。PCR反應系統：2 μL基因組DNA，正向和反向各5 μL 2×Taq Mix 12.5 μL引物(Aidlab Biotechnologies Co，Ltd)，將0.5 μL超純凈化水加入25 μL體系中。PCR在此項檢測中的擴充條件：94.0 ℃預變性3 min，94.0 ℃變性30 s，58.5 ℃、59.5 ℃及72 ℃各變性30 s，72.0 ℃擴增 5 min，擴增后再用2%瓊脂糖進行凝膠電泳，PCR擴增產物使用凝膠成像檢測，rs12041331反向引物為5′-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3′，正向引物為5′-CACTAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3′，將退火溫度設置為59.5 ℃，進行30次循環，內切酶為BCCI，酶切片段大?。篈A分別為178 bp和230 bp；AG分別為408 bp、178 bp及230 bp；GG為408 bp。取2 μL上述擴增產物，1 μL內切酶，2 μL的IOxNEB buffe，5 μL無菌雙蒸水，建立10 μL反應體系。37 ℃條件下，至少進行1 h酶切反應，之后終止。反應終產物與2%瓊脂糖一起制成凝膠，采用Gelred核酸染色，在140 V電壓和300 mA電流下，進行電泳，40 min后將該系統進行成像，觀察最終結果并拍照。PCR引物制作和受試者DNA測序交由上海生工生物工程股份有限公司操作。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 認知功能障礙組高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病比例及LDL-C水平高于認知功能正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組PEAR1 rs12041331位點多態性分布比較 認知功能障礙組野生型GG頻率低于認知功能正常組，純合突變型AA頻率高于認知功能正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組PEAR1 rs12041331位點多態性分布比較 單位：例(%)

2.3 初發腦梗死病人發生認知功能障礙的Logistic多因素回歸分析 以初發腦梗死病人是否發生認知功能障礙作為因變量，以高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病、LDL-C、PEAR1 rs12041331純合突變型(AA)為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示：PEAR1 rs12041331純合突變型(AA)、高齡、低教育程度、糖尿病與初發腦梗死病人認知功能障礙有關(P<0.01)。詳見表3。

表3 初發腦梗死病人發生認知功能障礙的Logistic多因素回歸分析

3 討 論

PEAR1是一種與巨核細胞生成及血小板活化有關的跨膜受體，其表達受DNA甲基化驅動，在血小板和內皮細胞中表達最多。PEAR1基因位于人類染色體1q23.1，包括22個內含子及23個外顯子，長度約30 kb。有研究顯示，PEAR1多個單核苷酸多態性位點與血管內皮功能和血小板活化等密切相關[6]，不同的PEAR1基因位點變化可能影響血小板的反應性。

正常情況下，PEAR1在人體外周血液血小板表面表達水平較低，在二磷酸腺苷、膠原相關多肽及其他應激情況下，PEAR1酪氨酸磷酸化和膜表達均增加，導致血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲa和GPⅡb結合，成為與纖維蛋白原特異性結合受體，后者與纖維蛋白原結合是引起血小板聚集的最終共同路徑，進而參與血栓形成[7]。有研究顯示，PEAR1基因與腦卒中和冠心病之間的關系，可能與其影響血小板激活，延緩巨核祖細胞增殖、分化等有關[8]。有研究顯示，PEAR1基因多態性可能與冠心病病人發生阿司匹林抵抗有關，其中AA型病人對阿司匹林抵抗最為嚴重[9]。陳靜靜等[10]研究表明，PEAR1基因rs12041331(GA+AA)是阿司匹林抵抗的獨立影響因素(P<0.05)，PEAR1基因rs12041331位點A等位基因與缺血性腦卒中病人發生阿司匹林抵抗有關。

PEAR1單核苷酸多態性位點與人體血小板的功能和反應有關，因此相關研究報道較多，單核苷酸多態性位點研究主要集中在rs12401331、rs4661012、rs9550270、rs11264579、rs1273215、rs1256688、rs3737224，其中rs12041331研究較多。Keramati等[11]研究顯示，通過基因測序發現PEAR1的532個變體中，內含子1變體rs12041331與所有受試者血小板聚集表型均相關，全基因組關聯分析結果顯示，與血小板聚集相關的內含子1變體是rs12041331。

Pi等[12]研究顯示，PEAR1單核苷酸多態性位點，特別是rs12041331、rs12566888，與心血管疾病的發生有關。PEAR1的單核苷酸多態性盡管與川崎病易患性無關，但rs12041331多態性可增加川崎病與冠狀動脈瘤的形成風險。Faraday等[13]研究顯示，PEAR1 rs12041331基因內含子變異影響相關蛋白的表達，而相關蛋白與血小板聚集相關的多種激動劑觸發和功能變異有關。

相關研究顯示，PEAR1 rs12041331 基因多態性與血小板功能及抗血小板藥物的療效有關[14]。有研究顯示，PEAR1 rs12041331與阿司匹林血小板聚集改變和心血管事件風險增加有關[15]。石秀錦等[16]研究顯示，我國人群PEAR1 rs12041331野生G基因頻率為0.61，突變A基因頻率為0.39，PEAR1單核苷酸多態性位點與病人血小板活性增高有關，突變型AG、AA血小板聚集率高于野生型GG，使用抗血小板聚集藥物(阿司匹林和/或氯吡格雷)情況下，突變型AG心血管事件發生率增高。李建設等[17]在114例初診腦梗死病人中發現3種PEAR1 rs12041331基因表型，其中野生型GG占50.9%，雜合突變型GA占42.1%，純合突變型AA占7.8%，突變型AG、AA即使長期堅持服用阿司匹林，病人腦梗死患病和復發概率均增加，除外吸煙、年齡、糖尿病、高水平LDL-C、其中PEAR1基因純合突變與腦梗死復發的相關性最強。

腦卒中具有高發病率、高復發率、高致殘率及高致死率的特點，是全球殘疾和致死的主要疾病之一[18]。腦卒中導致病人肢體和生活能力降低，但認知功能障礙起病隱匿，輕度認知功能障礙若未干預，極易錯過最佳恢復時機，給病人、家庭及社會帶來沉重的負擔[19]。

認知功能減退是急性腦卒中病人常見的臨床表現之一，包括認知障礙非癡呆至癡呆不同程度的認知障礙，該病發生機制尚未明確，導致早期診斷及治療困難，部分早期認知障礙非癡呆經過積極治療，可延緩疾病進程，若發展到癡呆階段，病人病情多表現為階梯式加重，病程呈波動性，治療難度加大。認知功能減退不但影響病人社會適應及日常生活能力，同時影響綜合康復治療與二級預防，主要危險因素包括高齡、低教育程度、復發性腦卒中等[20]。早期認識、預防和治療癡呆的相關危險因素可提高病人生活質量并減輕社會負擔，應引起臨床醫生廣泛重視，做到早期評估、早期預防。

目前，MMSE是國內外應用廣泛的認知篩查量表，該量表共30道題(回答正確得1分，回答錯誤或不知道得0分)，總分0～30分，包含以下7方面：時間定向力、地點定向力、即刻記憶、注意力及計算力、延遲記憶、語言和視空間。MMSE評分與文化水平密切相關，文盲>17分，小學>20分，初中及以上>24分[21]。曹輝等[22]研究顯示，MMSE可作為多發腔隙性腦梗死早期認知功能診斷的參考標準。

本研究單因素分析結果顯示，認知功能障礙組高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病比例和LDL-C水平高于認知功能正常組(P<0.05)。因此，干預常規危險因素，保持積極的學習和良好的生活方式，可有效控制代謝異常，可能降低認知功能障礙發生率。同時本研究結果顯示，認知功能障礙組野生型GG頻率低于認知功能正常組，純合突變型AA頻率高于認知功能正常組(P<0.01)，提示PEAR1基因多態性可能與認知功能障礙密切相關。多因素Logistic回歸分析結果顯示，PEAR1 基因 rs12041331純合突變(AA)、高齡、低教育程度、糖尿病與初發腦梗死病人認知功障礙的發生有關(P<0.001)。

PEAR1基因純合突變可增加復發風險，加速病人認知功能障礙的進程，且PEAR1基因純合突變影響抗血小板藥物活性和療效。基礎研究顯示，PEAR1除了在血小板和內皮細胞中高度表達外，同時發現其在衛星神經膠質前體細胞中表達，衛星神經膠質前體細胞與神經元細胞凋亡有關，進一步提示PEAR1可能與認知功能障礙病理生理有關[23]。因此，PEAR1的基因型分布可能與認知功能減退有關，病人年齡、低教育程度、吸煙、血糖、LDL-C水平及PEAR1 rs12041331位點(AA)均是初發腦梗死病人認知功障礙的獨立影響因素。

由于PEAR1基因多態性影響血小板功能和血小板聚集過程，因此PEAR1可作為影響腦血管疾病病人療效的必要因素。PEAR1多態性可能是腦梗死病人的一個危險因素，且PEAR1基因純合突變也可能是初發腦梗死病人認知功障礙的獨立危險因素，因此，通過基因檢測和PEAR1多態性評估管病人有助于改善療效，具體機制需進一步深入研究。

綜上所述，評估PEAR1基因多態性對預測初發腦梗死病人認知功障礙有一定的作用，初出發腦梗死病人應積極尋找認知障礙的危險因素，以便合理應用相關藥物，加強病人的綜合管理，對改善預后、提高生活質量具有重要的意義。PEAR1有多個基因多態性位點，在我國人群中均有分布，且存在一定的種族差異。本研究中研究對象局限，今后應進行涉及多個族群或群體，大樣本量和多個基因位點的研究，分析腦梗死病人認知功障礙的相關因素。