黃瓜雄性不育突變體C0128的鑒定與不育基因的初步定位

楊志敏，岳宏忠，張海強，李玉紅*

(1 西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊陵 712100；2 甘肅農業科學院 蔬菜研究所，蘭州 730070)

雄性不育不僅作為重要的農藝性狀多用于作物雜交育種和雜種優勢利用[1-2]，而且也是研究花藥發育的重要材料。擬南芥[3-4]、水稻[5-6]等模式植物關于雄性不育的報道較多且研究相對較深入，已克隆了多個雄性不育基因。葫蘆科作物的雄性不育材料較少，且研究多集中于雄性不育突變體表型鑒定、生理生化指標測定、細胞學觀察及突變體在育種中的應用方面[7-13]，關于雄性不育基因定位與克隆的報道較少[14-15]。因此，很有必要對葫蘆科作物雄性不育材料開展基因挖掘研究，為育種提供可利用的基因資源。

黃瓜(CucumissativusL.)是世界上最重要的蔬菜作物之一[16-17]。中國是全球黃瓜生產面積最大、產量最高的國家。2020年中國黃瓜種植面積達127萬hm2，占全球的56.4%(http://www.fao.org/faostat/en/)。據此估算，需要的黃瓜生產用種量達到1.3×103t。人工雜交制種是中國黃瓜種子生產的主要方法[18]，且栽培面積較大的華北型黃瓜很少有雌性系品種[1]，因此，雄性不育材料在黃瓜人工雜交育種生產中的應用會降低成本。對黃瓜雄性不育的研究，早期多集中于表型鑒定如無花瓣ap、多向性花粉敗育ms-1、雄花敗育ms-2、花朵閉合cl等雄性不育突變體的研究[10-13]，因這些突變體具有不良的農藝學性狀，未應用于育種實踐。近年來，對黃瓜雄性不育的研究有了新的進展。Zhang等[19]對花粉不育突變體ps進行遺傳研究，發現與雄花敗育突變體ms-2等位，但并未克隆MS-2雄性不育基因。Han等[14]克隆了黃瓜雄性不育突變體ms-3的候選基因，該基因編碼homeodomain (PHD) finger蛋白。Niu等[20]發現了一個與葉型相關的“mango”突變體，該突變體也具有雄性不育的性狀，圖位克隆了其候選基因CsWOX1，該基因編碼WUSCHEL-related homeobox1蛋白。此外，研究發現敲除擬南芥SPOROCYTELESS(AtSPL)的同源基因CsSPL可使黃瓜雄性和雌性育性均降低[21]；沉默擬南芥GLABRA2(AtGL2)同源基因CsGL2-LIKE會降低黃瓜雄性育性、延遲雄花開花[22]；反義抑制營養物質轉運相關基因HexoseTransporter1(CsHT1)會使黃瓜雄性育性降低、種子發育異常，下調SucroseTransporter1(CsSUT1)的表達會延遲黃瓜雄花發育、雄性育性降低甚至敗育[23-24]。

盡管已有上述研究，但通過正向遺傳學的方法僅克隆了ms-3候選基因，挖掘的雄性不育基因嚴重不足，非常有必要利用新的雄性不育突變體，開展黃瓜雄性不育基因的挖掘研究。本課題組從黃瓜EMS突變體庫中篩選到的1個性狀穩定遺傳的新雄性不育突變體C0128，本研究以該突變體為材料，對其不育特征及遺傳規律進行了分析，利用分子標記對突變體的不育基因(暫命名MS-4)進行初步定位，為進一步克隆目標基因、研究該基因功能及在農業生產上的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以雄性不育突變體C0128及野生型CCMC、育性正常的北美腌漬型黃瓜Gy14為試驗材料。以雄性不育突變體C0128作為母本，分別與CCMC和Gy14雜交，構建F1及相應的F2遺傳群體進行表型觀察、遺傳規律分析和基因定位。所有黃瓜材料種植于西北農林科技大學園藝場的塑料大棚里，常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變體C0128的雄花表型觀察分別隨機選5株突變體C0128與野生型植株，取開放前同一時期的雄花花芽和開放當天的雄花，于冰盒中帶回實驗室，在體式顯微鏡下觀察雄花發育情況。

1.2.2 突變體C0128育性鑒定在盛花期早晨8:00～10:00分別取野生型和突變體各10朵開放雄花于冰盒中，帶回實驗室進行TTC(質量濃度百分比為2%)染色觀察和花粉管體外萌發試驗。在載玻片中央滴1滴2%的TTC溶液，輕輕抖動雄蕊，使花粉均勻散在溶液中，蓋上蓋玻片置濕潤濾紙上，在35 ℃恒溫培養箱中染色10～15 min。用光學顯微鏡觀察染色情況，每張載玻片取花粉粒均勻的3個視野統計花粉敗育情況并進行顯著性分析。

在顯微鏡下觀察突變體和野生型的花粉萌發情況，花粉管的體外萌發方法參照王潔[25]，野生型和突變體各取5朵當天開放的雄花，每張載玻片在顯微鏡下選取花粉粒均勻的3個視野用于數據統計和分析，花粉管長度大于或等于花粉粒直徑的花粉粒表明其具有萌發能力[26]。

以野生型CCMC和突變體C0128作為親本，分別進行自交和正反交，即4種組合：CCMC?、C0128?、CCMC(♂)×C0128(♀)、C0128(♂)×CCMC(♀)，每個組合在不同植株上選10朵當天開放的雌花授粉。授粉后及時掛吊牌標明所做的雜交組合及雜交時間。授粉24 h后，次日同一時間點每個組合各取5組雌花和子房，放在冰盒中帶回實驗室。具體試驗方法參照Cheng[23]，染色后將組織放到載玻片上在熒光顯微鏡紫外光(405 nm)下觀察花粉管體內萌發情況并拍照分析。余下的5組授粉果，在授粉35 d后采收成熟的果實，剖開并觀察果實內部種子的發育情況。

1.2.3 不育性狀遺傳規律分析分別在田間觀察CCMC×C0128的F1、F2和Gy14×C0128的F1、F2共4個群體的單株表型，統計各群體的可育株與不育株的性狀分離比，用卡方測驗分析雄性不育性狀的遺傳規律。

1.2.4 目的基因的初步定位采用CTAB法分別提取兩親本C0128和Gy14的DNA，利用實驗室已有的、均勻分布在黃瓜7條染色體上的SSR引物和InDel引物，以兩親本的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，觀察分析電泳條帶結果，從而篩選出在兩親本間具有多態性的引物。采用混合分組分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)，在作圖群體中分別隨機選取7株雄性可育株和不育株，提取基因組DNA(質量濃度均控制在50 ng/μL)，等量分別混勻構建雄性可育池和雄性不育池。

利用在兩親本間篩選出的多態性引物，分別以兩池的DNA為模板，進行PCR擴增和PAGE電泳，在兩池間進一步篩選具有多態性的標記，確定雄性不育基因MS-4所在染色體。利用兩池間具有多態性的引物在Gy14×C0128 F2的64株作圖小群體中，以每個單株的DNA為模板進行PCR擴增和PAGE電泳，電泳帶型與突變體C0128帶型一致的記為A，與野生型Gy14帶型一致的記為B，與F1帶型一致的記為H。觀察分析小群體植株表型和電泳帶型結果，篩選交換單株，進行MS-4初步定位。然后在此基礎上，繼續擴大定位群體和開發新的標記，逐步縮小MS-4定位區間。

PCR反應和PAGE電泳分析參考Weng等[27]，連鎖分析參見Rong等[28]。

2 結果與分析

2.1 突變體C0128的雄花表型觀察

突變體除雄花發育存在差異外，在其他主要農藝性狀如株高、莖粗等方面與野生型植株無差異。突變體的雄花具有正常形態的花萼(圖1，A-B)，花瓣和花藥小于野生型，花藥顏色與野生型一樣呈現金黃色，但花藥上無明顯的花粉粒(圖1，C-D)。

2.2 突變體C0128花粉育性分析

花粉粒的TTC染色和花粉體外萌發試驗結果表明，野生型的花粉粒大多數可以被染成紅色(圖2，B)，且多數花粉粒經過25 ℃孵育2 h后花粉管明顯伸長(圖2，D)，花粉活力和萌發率均在80%以上(圖2，E-F)；而突變體雄花在視野下無花粉及花粉粒萌發(圖2，A、C)，說明突變體的雄性不育是由于花粉粒的缺失造成的。

利用苯胺藍染色法對花粉在體內萌發情況進行研究，結果發現野生型CCMC作為父本的組合，柱頭上附著的花粉粒(圖3，A、C)及在子房中已萌發伸長的花粉管(圖3，B、D)均可以被苯胺藍染色，而突變體C0128作為父本的組合檢測不到柱頭上的花粉粒(圖3，E、G)及子房中萌發的花粉管(圖3，F、H)，再次驗證了突變體C0128是花粉缺失型突變體。

對上述4種組合的果實進行留種觀察，結果發現野生型CCMC作為父本的組合均可以獲得正常發育且飽滿的種子(圖4，A-B)，而突變體C0128作為父本的組合內部全為癟種子，剝開種皮發現沒有胚和胚乳(圖4，C-D)。該結果表明突變體作為父本子代不育，但作為母本子代可育，說明突變體C0128雄性不育，但雌性可育。

2.3 突變體雄性不育表型的遺傳規律分析

CCMC×C0128和Gy14×C0128的F1代植株雄花和雌花發育均表現正常。在CCMC×C0128的146株F2群體中，可育株∶不育株為103∶43，分離比約為3∶1(P=0.214 1)；在Gy14×C0128的1 231株F2群體中，可育株∶不育株為908∶323，分離比也約為3∶1(P=0.315 5)。經卡方測驗符合孟德爾遺傳定律，表明突變體C0128的雄性不育性狀可能由1對隱性核基因調控。

2.4 突變體雄性不育基因MS-4定位

利用實驗室已合成的均勻分布在黃瓜7條染色體上的SSR引物和InDel引物，在兩親本之間篩選出110對具有多態性的引物，進一步在雄性可育池/不育池之間篩選，共篩選出8對在兩池間具有多態性的引物(表1)，且這8對多態性SSR引物都位于黃瓜第3染色體上。

表1 突變體C0128雄性不育基因MS-4定位所用標記Table 1 Markers for MS-4 mapping of mutant C0128 male sterile gene

利用這8對多態性引物在64株的作圖小群體中進行MS-4的初步定位，構建初定位遺傳圖譜(圖5，A)，將MS-4定位在Chr3的Li162和Li172兩個標記之間的5.1 Mb區間內。在該定位區間開發sf06、sf14、sf46和sf43共4對與MS-4緊密連鎖的SSR分子標記，并擴大定位群體至1 231株，最終將MS-4定位在sf14和sf46兩個標記之間1.21 Mb區間內(圖5，B)。

通過葫蘆科基因組網站對MS-4定位的1.21 Mb區間基因進行分析，發現該區間內共有149個基因，主要編碼轉錄因子(如MYB、bHLH等轉錄因子)、各種酶類(如激酶、轉移酶、合成代謝酶)和蛋白質等。149個基因中有8個基因可能會影響黃瓜雄性育性，分別是CsaV3_3G015960、CsaV3_3G016780、CsaV3_3G016880、CsaV3_3G017010、CsaV3_3G017120、CsaV3_3G017190、CsaV3_3G017210、CsaV3_3G017220，分別編碼轉錄因子RF2a(Transcription factor RF2a)、雙組分響應調節器ARR14-like(Two-component response regulator ARR14-like)、雄蕊特異蛋白FIL1-like(Stamen-specific protein FIL1-like)、皮瓣核酸內切酶GEN-Like(Flap endonuclease GEN-like)、假定的肌動蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor, putative)、細胞色素P450(Cytochrome P450)、信號肽類肽酶3(Signal peptide peptidase-like 3)、裂解和多聚腺苷酸化特異性因子亞基2(Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2)。

3 討 論

黃瓜上目前已鑒定的雄性不育突變體主要有6個：1)無花瓣敗育ap，該突變體花冠缺失，花藥向花萼方向生長轉化；2)多向性花粉敗育ms-1，其雄花不能開放、花粉不育率為30%～90%，且雌花育性降低；3)雄花敗育ms-2，極少數的雄花開放，但花藥發育異常，不能產生花粉；4)花朵閉合cl，雌雄花都不能開放；5)花粉敗育ps，雌雄花的花冠正常，雌花可育，雄蕊花藥退化、無花粉；6)雄性不育ms-3，雌雄花都有正常的花冠，雌花的育性正常，但雄花花藥淡綠色、花粉缺失[10-14,19]。此外，還有Niu等[20]發現的葉子皺縮不平展、花瓣變窄、果實形似芒果的“mango”突變體也具有雄性不育的特征。而在本研究中突變體C0128花瓣變小但形狀正常，花藥變小、顏色正常，雌花正常可育。這些形態特征表明突變體C0128與之前已報道的黃瓜雄性不育突變體不同，是一個新的黃瓜雄性不育突變體材料。

在擬南芥、水稻等模式植物上已克隆了多個雄性不育基因，涉及幾個轉錄因子和酶類。轉錄因子主要通過調控花藥發育途徑從而影響雄性育性，如MYB類轉錄因子MYB103/188、bHLH類轉錄因子DYT1、AMS等等[29]；酶類主要通過合成、轉化或降解等過程為花藥發育提供所需要的物質，如GDSL[30]、KCS[31]、ACOS5[32]等，還有一些激酶HXK5[33]和轉移酶GPAT6[34]等也參與花藥發育。在葫蘆科作物中克隆的雄性不育基因較少，西瓜上僅克隆了2個雄性不育基因Cla006625和Cla010576，分別編碼Pollen-specific leucine-rich repeat蛋白[35]和與擬南芥的bHLH091、bHLH089、bHLH010同源的bHLH轉錄因子[36]。甜瓜上僅克隆了雄性不育突變體ms-5的候選基因CmAMS，其編碼bHLH家族的MYC類轉錄因子[37]。黃瓜上，Han等[14]圖位克隆了雄性不育基因MS-3的候選基因，其編碼homeodomain(PHD) finger蛋白；Niu等[20]圖位克隆了 “mango”突變體的目的基因Csa1M042780，編碼WUSCHEL-related homeobox1蛋白，該基因突變不僅影響葉形、果形、花形，還抑制花藥及花粉發育，導致花粉異常。上述已克隆的葫蘆科作物雄性不育基因均不在MS-4定位區間內。

本研究MS-4定位區間內的149個候選基因中，有8個候選基因的同源基因在其他植物上已被報道會影響植物雄性育性。CsaV3_3G015960的同源基因DRINKME(DKM)，在擬南芥過表達植株中，花藥變小、花粉量減少，降低了雄性育性[38]；CsaV3_3G016780的同源基因編碼Response Regulator2(ARR2)是花粉特異性轉錄因子，通過調控擬南芥花粉發育途徑影響花粉發育[39]；CsaV3_3G016880的同源基因編碼A9啟動子，是擬南芥最早發現的一個絨氈層特異性啟動子，通過與轉錄因子結合調控雄性生殖器官發育影響育性[40]；CsaV3_3G017010的同源基因OsGEN-Like，在水稻中沉默后大部分植株會降低雄性育性甚至敗育，其敗育是由于早期小孢子發育缺陷而不能產生成熟花粉[41]；CsaV3_3G017120同源基因編碼的Actin-Depolymerizing Factor 10(ADF10)在擬南芥中主要通過影響花粉管的生長從而影響雄性育性[42]；CsaV3_3G017190的同源基因CYP715A1是Cytochromes P450家族成員，在擬南芥花蕾的絨氈層和開花的花藥中特異性表達[43]，可能與雄性育性相關；CsaV3_3G017210在擬南芥中的同源基因編碼Signal Peptide Peptidases(AtSPP)，AtSPP是擬南芥雄配子體發育和花粉成熟所必需的因子[44]；CsaV3_3G017220的同源基因編碼Defective in snRNA Processing 1/4復合體(DSP1/4)，DSP1/4突變后都會影響擬南芥雄配子體的發育，且雙突變體表現為雄性不育[45-46]；在本研究中突變體C0128不能產生花粉粒，除推測CsaV3_3G015960和CsaV3_3G017120可能不是MS-4候選基因外，其余6個候選基因均有可能是MS-4的候選基因，需進一步擴大定位群體對MS-4進行精細定位和克隆才能初步確認MS-4的候選基因。

作者貢獻：楊志敏完成了本研究的主要內容及手稿撰寫；岳宏忠參與試驗設計，提供試驗指導，引物設計與合成；張海強負責構建雜交群體；李玉紅教授設計本研究、試驗指導及論文修改。所有作者都對文章作出了貢獻，并批準提交。