2型糖尿病合并骨質疏松癥患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4與糖脂代謝、骨密度及骨代謝標志物的相關性

宋茜茜，尹飛，郭淑芹，姚明言，李志紅

骨質疏松癥是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常見并發癥，隨著肥胖和老齡化人口增加，T2DM合并骨質疏松癥的發病率不斷增加，一項系統分析顯示，T2DM患者骨質疏松的患病率為37.8%，且隨著年齡的增長而增加[1]。骨質疏松癥患者骨密度降低，骨脆性增加，發生骨折風險增高，生存質量嚴重降低。骨質疏松癥由成骨細胞和破骨細胞間平衡紊亂引起，破骨細胞過度活化導致骨吸收增加是引起骨質疏松癥的主要原因。趨化因子可調節白細胞和其他炎性細胞遷移和浸潤，引起破骨細胞活化，在骨質疏松發病機制中發揮重要作用[2]。C-X3-C趨化因子配體1(C-X3-C chemokine ligand 1，CX3CL1)是一種膜結合趨化因子，可調節免疫細胞遷移和黏附誘導炎性反應，并可誘導破骨細胞分化，促使骨吸收[3]。細胞因子配體3(cytokine ligand 3，CCL3)是一種促炎性趨化因子，轉錄調節炎性反應過程，同時可促使破骨細胞前體遷移，破骨細胞分化，增加破骨細胞數量和大小[4]。細胞因子配體4(cytokine ligand 4，CCL4)在破骨細胞前體細胞中高度表達，可促使核因子-κB 配體(RANKL)介導破骨細胞前體細胞從骨髓遷移至骨表面，為破骨細胞分化增殖提供條件[5]。CX3CL1、CCL3、CCL4是否與T2DM合并骨質疏松癥有關尚不清楚，目前缺乏相關報道，鑒于此，本研究擬檢測T2DM合并骨質疏松癥患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平，分析其間關系，為臨床診治和預防提供借鑒，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年2月—2021年2月保定市第一中心醫院內分泌二科收治T2DM患者322例，根據是否發生骨質疏松癥將患者分為骨質疏松組115例和非骨質疏松組207例。骨質疏松組患者年齡、BMI、T2DM病程、既往吸煙史比例均大于非骨質疏松組(P<0.05)，補充鈣劑比例低于非骨質疏松組(P<0.05)，性別、收縮壓、舒張壓、既往飲酒史、基礎疾病等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經醫院倫理委員會審核批準(倫審2018063)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 骨質疏松組與非骨質疏松組臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①T2DM符合“中國2型糖尿病防治指南(2017年版)”[6]診斷標準，骨質疏松癥符合“原發性骨質疏松癥診療指南(2017)”[7]診斷標準；②年齡18歲以上。(2)排除標準：①使用激素替代療法、雙膦酸鹽、糖皮質激素、質子泵抑制劑等；②合并急慢性感染、自身免疫性疾病；③合并惡性腫瘤。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清CX3CL1、CCL3、CCL4檢測：患者入組后均采集空腹肘靜脈血3 ml注入干燥試管，待凝固后取上層液離心取血清待測。采用FK-SY96S多功能酶標分析儀(山東方科儀器有限公司)運用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平。

1.3.2 糖脂代謝指標檢測：上述血清標本，使用全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter 公司，型號AU5800)測定三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。電化學發光分析儀(美國Roche 公司，型號Cobas 8000)測定空腹胰島素(FINS)，高效液相色譜儀(美國Bio-Rad公司，D-10 系統)測量糖化血紅蛋白(HbA1c)。另取靜脈血標本，采用穩態血糖儀(美國強生公司)檢測空腹血糖(FPG)，穩態模型計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。

1.3.3 骨代謝指標檢測：上述血清標本，采用FK-SY96S多功能酶標分析儀運用酶聯免疫吸附試驗檢測血清Ⅰ型膠原羧基端肽β-膠原特殊序列(β-CTX)、骨鈣素N-端中分子片段(N-MID)、骨堿性磷酸酶(B-ALP)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PⅠNP)、Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PⅠCP)、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶異構體5b(TRACP-5b)，試劑盒購自上海酶聯生物公司。

1.3.4 骨密度測量：雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司，型號Discovery-WI)測定全髖、股骨頸和L1～4脊柱的骨密度(g/cm2)，取所有部位的骨密度平均值。

2 結 果

2.1 2組血清CX3CL1、CCL3、CCL4比較 骨質疏松組血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平高于非骨質疏松組(P<0.01)，見表2。

表2 骨質疏松組與非骨質疏松組血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平比較

2.2 2組糖脂代謝指標、骨代謝指標、骨密度比較 骨質疏松組HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、TRACP-5b均高于非骨質疏松組(P<0.05)，B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度低于非骨質疏松組(P<0.05)，FPG、FINS、TG、HDL-C、LDL-C比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 骨質疏松組與非骨質疏松組糖脂代謝指標、骨代謝指標、骨密度比較

2.3 血清CX3CL1、CCL3、CCL4與糖脂代謝、骨代謝指標、骨密度的相關性 血清CX3CL1、CCL3、CCL4與HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、TRACP-5b均呈正相關(P<0.05)，與B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度呈負相關(P<0.05)，與FPG、FINS、TG、LDL-C、HDL-C無相關性(P>0.05)，見表4。

表4 血清CX3CL1、CCL3、CCL4與糖脂代謝、骨代謝指標、骨密度的相關性分析

2.4 T2DM患者發生骨質疏松癥的多因素Logistic回歸分析 以骨質疏松癥為因變量(賦值：0=否，1=是)， 以年齡、BMI、T2DM病程、既往吸煙史(賦值：0=否，1=是)、補充鈣劑(賦值：0=否，1=是)、HbA1c、HOMA-IR、TC、β-CTX、N-MID、B-ALP、PⅠCP、TRACP-5b、骨密度、CX3CL1、CCL3、CCL4為自變量，建立多因素Logistic回歸方程。結果顯示，HbA1c、BMI、CX3CL1、CCL3、CCL4升高是T2DM患者發生骨質疏松癥的危險因素(P<0.05)，補充鈣劑是保護因素(P<0.05)，見表5。

表5 T2DM患者發生骨質疏松癥的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

T2DM是一種常見疾病，高循環葡萄糖水平可導致視網膜病、糖尿病腎病、腦卒中和心肌梗死等微血管和大血管并發癥，還可導致骨髓血管破壞，引起骨質疏松癥。目前研究顯示，晚期糖基化終產物在骨質中積聚、骨微血管損傷、慢性炎性反應狀態、成骨細胞和破骨細胞失衡等與T2DM患者發生骨質疏松癥有關[8]。骨組織生成及其吸收間平衡紊亂與骨質疏松癥密切相關，趨化因子作為先天免疫系統的關鍵調節劑，通過自分泌和旁分泌機制控制炎性反應期間免疫細胞的遷移、定位和功能，影響破骨細胞和成骨細胞分化，調節骨形成和吸收，與生理和病理條件下骨重塑密切相關[9-11]。

CX3CL1是一種跨膜趨化因子，包含趨化因子/黏蛋白混合結構和跨膜結構域，具有黏附分子和趨化劑的雙重功能，其編碼基因位于染色體16q13，主要在活化的內皮細胞、活化的成纖維細胞和成骨細胞上表達，其特異性受體CX3C受體1(CX3CR1)在淋巴細胞、單核細胞/巨噬細胞和破骨細胞上表達，CX3CL1通過與CX3CR1結合發揮作用，包括促使免疫細胞對血管內皮細胞的捕獲和牢固黏附，促使單核細胞募集炎性細胞，趨化其他趨化因子遷移等[12-13]。已知CX3CL1/CX3CR1軸與神經系統疾病、腎臟疾病、惡性腫瘤等多種疾病的發生有關[14-16]。本研究發現，骨質疏松組血清CX3CL1水平明顯高于非骨質疏松組，且與HbA1c、HOMA-IR、TC呈正相關，表明CX3CL1參與T2DM糖脂代謝紊亂過程。CX3CL1/CX3CR1軸異常可導致M2極化巨噬細胞遷移減少，M1極化巨噬細胞遷移增加，損害葡萄糖耐量，降低胰島素敏感性，導致胰島素抵抗[17]。進一步分析顯示，血清CX3CL1與骨密度和骨代謝指標有關，血清CX3CL1水平增高是T2DM患者發生骨質疏松癥的危險因素，表明血清CX3CL1參與T2DM骨代謝紊亂及骨質疏松發生過程。CX3CL1/CX3CR1軸在破骨細胞募集和破骨細胞生成中也發揮重要作用。Han等[18]研究表明，CX3CL1在受電離輻射小鼠骨骼組織血管內皮中表達顯著上調，CX3CL1促進外周循環中破骨細胞前體細胞高度表達CX3CR1，或通過激活缺氧誘導因子-1 α增加基質細胞衍生因子-1、巨噬細胞炎性蛋白-2等趨化因子生成，促使破骨細胞增殖，促進骨吸收。

CCL3也稱巨噬細胞炎性蛋白α，屬于低分子量趨化因子CC亞家族的成員，在單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞中表達，參與炎性反應調節過程[19]。CCL3通過其受體—— CC趨化因子受體1(CCR1)促使單核細胞衍生巨噬細胞誘導滑膜炎性反應，參與膝關節骨關節炎進展[20]。本研究發現，CCL3與T2DM糖脂代謝異常有關，Sindhu等[21]同樣發現，T2DM患者血清CCL3水平顯著升高，趨化因子通過募集嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞至炎性反應部位促使炎性因子釋放，參與代謝失調過程，與T2DM葡萄糖和脂質代謝紊亂及胰島素抵抗有關。本研究結果表明，血清CCL3與β-CTX、N-MID、TRACP-5b均呈正相關，與B-ALP、PⅠNP、PⅠCP、骨密度均呈負相關，血清CCL3升高是T2DM患者骨質疏松癥的危險因素之一。Collins等[22]發現破骨細胞中CCL3表達明顯增強，其表達上調與死亡受體3/TNF樣蛋白1A信號通路激活有關。Gong等[23]研究表明，細胞外信號調節激酶/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白通路激活可刺激骨髓來源的單核細胞產生CCL3，促使破骨細胞分化，而抑制CCL3可減少骨吸收和骨溶解。

CCL4也稱巨噬細胞炎性蛋白-1β，屬于CC趨化因子家族的成員，位于17號染色體，可驅使巨噬細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、未成熟樹突細胞和冠狀動脈內皮細胞，誘導炎性反應，導致心血管功能障礙，并損害外周肌肉組織對葡萄糖的攝取，參與動脈粥樣硬化心血管疾病及T2DM發病過程[24]。本研究結果證實，T2DM患者血清CCL4水平與HbA1c、HOMA-IR、TC呈正相關，提示CCL4水平異常可能引起T2DM糖脂代謝異常。現有報道顯示，CCL4可在胰島β細胞炎性反應損傷中，通過驅使巨噬細胞遷移至胰腺引起胰島β 細胞凋亡導致胰島素敏感性降低和胰島素抵抗[24]。Chang等[25]報道指出抑制CCL4可降低腫瘤壞死因子-α和白介素-6水平，維持葡萄糖穩態，降低TC、TG 和HDL-C水平，表明CCL4異常與糖脂代謝紊亂有關。本研究回歸分析結果顯示，血清CCL4升高是T2DM患者發生骨質疏松癥的危險因素，CCL4與骨代謝紊亂和骨密度降低有關，提示CCL4可能參與T2DM骨質流失的過程。CCL4被認為是破骨細胞特異性基因，在骨吸收和遷移中起重要作用，Kim等[26]通過將RAW264.7細胞培養在骨表面孔中并用RANKL處理誘導破骨細胞分化，可觀察到CCL4表達明顯增高，表明CCL4參與RANKL誘導的破骨細胞遷移和分化過程，CCL4可能通過PI3K通路介導RANKL誘導的破骨細胞遷移過程[5]。

本結果顯示，HbA1c、BMI與T2DM患者發生骨質疏松癥也存在密切關系，表明血糖控制不佳及肥胖可能增加T2DM患者罹患骨質疏松風險，賈椏鈞[27]也指出HbA1c水平與T2DM患者發生骨質疏松幾率呈正相關。王劍等[28]報道結果也顯示，肥胖患者骨質疏松癥發生率較高。補充鈣劑是骨質疏松癥的保護因素，提示臨床對于T2DM患者應注重鈣劑補充，以預防骨質流失和骨量減少。

綜上，T2DM合并骨質疏松癥患者血清CX3CL1、CCL3、CCL4水平均升高，高水平血清CX3CL1、CCL3、CCL4與T2DM患者糖脂代謝紊亂、骨代謝異常和骨密度降低均有關，是T2DM患者合并骨質疏松癥的危險因素。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

宋茜茜：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，論文修改；尹飛、郭淑芹：實施研究過程，資料搜集整理；姚明言：進行統計學分析；李志紅：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核