中藥復方及單體成分調節自噬改善骨關節炎的研究進展

曾凡，王康，陳柏屹，段航，鄺高艷，盧敏*

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.懷化市中醫院，湖南 懷化 418000；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是全球范圍內最普遍的慢性筋骨退行性疾病，也是致殘的主要原因之一，其主要特征是關節軟骨流失、滑膜炎性變化及關節組織重塑。主要表現為關節周圍疼痛、畸形、穩定性和運動功能減退，對患者的身心健康、生活質量等多方面帶來嚴重負面影響[1-2]。作為一種與年齡相關的關節疾病，全球60歲以上的老齡人群中大概有18%的女性、9.6%的男性出現骨關節炎癥狀，并且，其發病率還在持續上升[3]。由于OA的發病機制尚未完全闡明，目前，大多數針對OA的治療策略側重于緩解癥狀，而不是扭轉疾病的發展，因此，處于OA晚期的患者在沒有更好選擇的情況下不得不接受關節置換[4]。近年來，自噬因其在各種疾病的發病機制和調節衰老過程中的作用而引起了人們的興趣。大量相關研究顯示，自噬參與OA的病理進展過程，在OA發生發展過程中具有不可忽視的作用[5-6]。伴隨著中醫藥現代化進程的不斷推進，通過中醫藥干預治療OA的基礎和臨床研究取得諸多新的研究成果,本文擬對中醫藥通過調控自噬干預治療骨關節炎的相關研究進展進行綜述。

1 細胞自噬相關概述

“自噬”這一術語由科學家Christian de Duve首次提出[7]。在真核生物中，自噬已被表征為一種高度調節的細胞機制，具有有益和致病雙重作用[8]。根據需要降解的成分將以何種方式轉移至溶酶體的不同，自噬可分為:巨自噬、微自噬、分子伴侶介導自噬，其中主要以巨自噬為主[9]。

自噬可人為的分為以下步驟。(1)自噬體膜的形成：自噬在細胞中被激活后，通過雷帕霉素靶蛋白(mTOR)使絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ULK1脫磷酸化，進而誘導ATG13、FIP200與ULK1結合，形成ATG13-ULK1-FIP200穩定復合體，誘導在細胞質中某些區域形成一個新月形的脂質雙層扁平膜樣結構，即自噬體膜。(2)自噬體的形成：自噬體膜不斷延伸，ATG蛋白聚集并形成泛素樣結合系統，促進微管相關蛋白LC3與磷脂磷脂酰乙醇胺PE結合，形成LC3Ⅱ，結合到自噬體膜中促進自噬體膜的閉合，形成自噬體，此為自噬過程中最為關鍵的步驟。(3)自噬體的運輸融合：自噬體通過與細胞內內吞成分如溶酶體進行融合而成熟，形成自噬性溶酶體。(4)自噬體的降解：自噬性溶酶體的內容物在溶酶體酶的作用下發生降解，在降解階段，被包裹的細胞內大分子被分解為氨基酸、核苷酸和能量，從而被細胞回收利用[10-11]。

正常生理條件下，自噬在細胞中處于低水平狀態，但在面對各種應激反應狀態時，如缺氧、營養缺乏、代謝障礙、氧化應激等，可誘導自噬的發生[12]。一定程度的自噬激活，機體可通過細胞自噬，消除、降解功能異常的細胞器、變性蛋白質等物質，提供細胞再生和修復所必需的原料，達到細胞再循環和物質再利用[13]，從而提高細胞在應激狀態下的適應能力；然而當應激狀態超過細胞所能接受的最大適應能力時，則會導致過度自噬，進而導致細胞死亡。因此，自噬如同一把雙刃劍，具有有益和致病雙重作用，這取決于細胞所能接受的自噬的誘導程度及持續時間[14]。

2 自噬與OA

OA是一種涉及多種因素，包括機械、遺傳、衰老等而導致的慢性關節疾病，關節軟骨退變為其重要病理改變[15]。關節軟骨的退化是骨關節炎發病機理的中心，軟骨細胞是軟骨目前研究中發現的主要細胞類型，軟骨外基質的合成和更新依賴于軟骨細胞的參與與維持，所以防止軟骨變性的重要因素之一是將軟骨細胞維持在健康的狀態[16]。

軟骨退變在骨關節疾病進展過程中的特點，主要為細胞內出現功能異常受損的細胞器和需要降解的大分子物質不斷持續累積對軟骨細胞造成損害，而合適水平自噬的激活則可以在一定程度上有效的清理受損的細胞器以及需要降解的大分子物質，進而防止軟骨細胞受到損害,提供良好的細胞內環境從而利于軟骨細胞的存活。因此，在退變或損傷的細胞中激活自噬，可能為一種可行的、有效減緩甚至阻止關節軟骨退變進程的新方法[17]。因此，近年來，通過自噬激活抑制軟骨細胞凋亡引起廣泛探索[18]。Caramés等[19]通過研究發現，在人類OA、小鼠衰老相關和手術誘導的OA中出現ULK1、Beclin1和LC3表達的減少和軟骨細胞凋亡增加，并且這些自噬關鍵因子的減少伴隨著軟骨細胞凋亡的增加，證實了受損的自噬可能有助于OA的發展。Bohensky等[20]研究表明在異常環境下如低氧或高壓，軟骨細胞內自噬的激活有利于增強細胞適應環境的能力，提高細胞的生存率，Xue等[21]發現，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可顯著促進了OA大鼠的關節軟骨細胞的自噬水平并減輕其炎癥反應，保護關節軟骨。Lian等[22]通過在關節腔內強制表達miR-128a，誘導Atg12丟失抑制軟骨細胞自噬后，軟骨基質降解加快以及OA組織病理學進展變得更加明顯，而關節腔內注射miR-128a反義寡核苷酸穩定軟骨細胞的自噬后，關節組織包括軟骨侵蝕、滑膜炎、骨贅形成和軟骨下板損傷速度均得到減緩，提示自噬對OA的保護作用。以上研究均表明，自噬在軟骨細胞的病理生理以及OA的發展過程中均有著不可忽視的作用，因此，以自噬為靶點可能是治療OA新的治療策略。

3 中醫藥調控自噬治療骨關節炎

3.1 單味中藥及中藥單體

隨著中醫藥現代化的進展，中藥有效成分得到不斷闡明，中藥單體因其效果顯著、成分明確，近年來得到廣泛研究。

續斷于《神農本草經》首見記載，為多年生植物川續斷的干燥根，功可補肝腎，強筋骨?，F代藥理學研究研究顯示，其具抗氧化、抗炎、骨保護等廣泛作用，其中骨保護為續斷最具特點的藥理作用，巧妙地暗合了古人廣泛運用此種藥物于傷科治療，并取名續斷的思想[23]，現代臨床常用于治療腰肌勞損、骨關節疾病等[24]。續斷總皂苷為其主要成分，商連斌等[25-26]研究發現續斷總皂苷可以上調KOA小鼠關節軟骨組織中Atg3、Atg4、Atg7表達水平，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的過度活化，從而促進自噬的發生，由此達到保護關節軟骨的作用。白楊素為中藥木蝴蝶中提取的一種具有抗氧化、抗病毒等諸多藥理作用的黃酮類化合物，楊陽等[27]證實白楊素可抑制脂多糖誘導的軟骨細胞中PI3K/AKT信號通路的激活作用，下調軟骨細胞中表達的Beclin-1及LC3，抑制軟骨細胞過度自噬，進而保護軟骨細胞。白藜蘆醇廣泛存在于藜蘆、虎杖等藥用植物中的一種抗毒素，具有強大的抗炎特性，能夠有效抵消IL-1β介導的促炎分解代謝，明顯改善炎癥條件下軟骨外基質的沉積，在關節軟骨修復、延緩骨關節炎進展方面表現出巨大潛力[28]。董鑫等[29]通過高脂喂食誘導肥胖相關小鼠OA，予以白藜蘆醇治療后，發現其能夠有效降低肥胖導致的過度自噬水平，改善肥胖相關骨關節炎病理改變。Qin等[30]則通過半月板失穩術制備OA小鼠模型并局部關節腔內注射白藜蘆醇，發現白藜蘆醇關節內注射可以延緩關節軟骨的退化，并進一步證明這可能與調控AMPK/mTOR信號通路、促進軟骨細胞自噬有關。光甘草定是提取自甘草的一種具有極強抗氧化能力黃酮類化合物，戴紀杭等[31]通過OA大鼠膝關節腔注射光甘草定發現其能有效延緩大鼠OA的進展，并通過體外實驗進一步驗證，光甘草定能夠激活mTOR介導的自噬途徑，促進軟骨細胞中Atg5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及Beclin1的表達，抑制人軟骨細胞的凋亡，顯示出光甘草定用于防治OA的可行性。芍藥苷是芍藥的主要藥效成分，姚旭等[32]研究發現，軟骨細胞經IL-1β處理后，細胞中自噬水平下降，而予以芍藥苷干預后，PI3K/AKT信號被抑制，軟骨細胞中LC3Ⅱ及Beclin-1表達水平上升，自噬活性增加，并同時降低了炎癥因子濃度水平，有效緩解了軟骨細胞的損傷。牛膝常用于治療痹證，植物化學和藥理學研究證實牛膝多糖為中藥牛膝的主要活性成分，基礎研究證實其能夠有效抑制caspase-3的激活，下調促凋亡蛋白Bad和Bax、上調抗凋亡蛋白Bcl-xL表達水平，抑制p53蛋白磷酸化等作用來抑制IL-1β誘導的細胞凋亡，保護軟骨細胞[33]。李晨春等[34]研究表明，牛膝多糖還可通過促進軟骨細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平，降低Fadd的表達，改善骨關節炎軟骨細胞中的自噬水平，減少軟骨細胞的凋亡。姜黃素是姜黃根莖中最活躍的成分，在一系列與慢性炎癥相關的疾病中展現出良好的治療效果，其中，將其用于OA治療的相關研究中，它被證實具備可靠的抗氧化應激、抗凋亡及抗分解代謝作用[35]。李亞楠等[36]、Li等[37]、李曉東等[38]均通過體外實驗證實姜黃素可提高自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達，誘導軟骨細胞自噬抑制細胞凋亡和炎癥信號的傳導，促進軟骨細胞修復、增殖，發揮軟骨保護作用。淫羊藿的主要成分之一淫羊藿苷具有多種藥理作用，包括對軟骨細胞損傷的保護作用。Bobin等[39]、Tang等[40]通過體內及體外實驗發現，對OA大鼠予以淫羊藿苷治療后，OA軟骨組織的嚴重病理狀態得到了顯著緩解，并呈劑量依賴性方式激活軟骨細胞的自噬，并降低軟骨細胞凋亡率，通過介導 PI3K/AKT/mTOR 及NF-κB信號傳導調節軟骨細胞的自噬來緩解 OA 癥狀。當歸于《神農本草經》中首載，為生血活血之主藥，亦具宣通氣分、祛風開痹之功效[41]，當歸多糖為其主要成分，具有顯著的抗衰老、免疫調節、神經保護等作用。一些研究表明[42]，當歸多糖能夠通過其抗氧化、抗炎作用保護軟骨細胞免受過氧化氫誘導的氧化應激和隨后的細胞凋亡。Xu等[43]進一步探究得出當歸多糖能夠通過ERK1/2信號通路激活軟骨細胞中的自噬，保護軟骨細胞免于凋亡。上述研究表明多種中藥及中藥單體可通過多種途徑調控軟骨細胞自噬相關關鍵因子表達水平，從而發揮保護關節軟骨的作用。

3.2 中藥復方

近年來，有關中藥復方參與調控軟骨細胞自噬的相關研究成為熱點。暴丁溯等[44]通過臨床研究觀察發現，相較于常規西藥治療，加服芍藥甘草附子湯的患者軟骨自噬相關蛋白Beclin-1表達上升，PI3K、pAkt、mTOR表達降低，軟骨細胞自噬水平提高，患者骨關節炎相關癥狀較西藥治療組得到更加顯著的緩解。盧巖巖等[45]使用臨床對照試驗研究的方法發現補腎活血方能夠有效緩解膝骨關節炎患者疼痛，改善關節功能評分，隨后進一步通過動物實驗發現其能有效降低KOA小鼠血清炎癥水平，減少軟骨外基質的降解，其作用機制可能與激活軟骨中的自噬及抑制相關炎癥信號通路有關。劉璞等[46]通過IL-1β誘導制備KOA軟骨細胞模型，通過予以加味陽和湯含藥血清干預后發現，其能有效下調KOA軟骨細胞模型中的炎性因子IL-6、TNF-α、MMP-13水平，并上調軟骨細胞中自噬關鍵因子的表達，反應了加味陽和湯可調控軟骨細胞自噬水平，并且降低炎癥水平，從而發揮對軟骨細胞的保護作用。沈金明等[47]對成模骨關節炎大鼠予以四妙散治療，結果顯示予以四妙散治療后軟骨細胞中LC3的表達得到提高，而Fadd、Caspase-3的表達出現降低，大鼠骨關節炎進展得到緩解，提示軟骨細胞的凋亡可能被中藥復方四妙散激活的軟骨細胞自噬作用所抑制。顏春魯等[48]通過改良Hulth法制備大鼠膝骨關節炎模型，并對其予以右歸丸治療，檢測結果發現不同濃度的右歸丸均可在一定程度上影響軟骨組織中自噬相關蛋白的表達，提高自噬水平，延緩軟骨組織退變。秦娜等[49-50]通過予以KOA模型鼠桃仁膝康丸治療12周后，關節軟骨組織中細胞外基質降解受到抑制，自噬相關蛋白質表達得到增高，提示桃仁膝康丸能夠對鼠KOA模型軟骨具有一定的保護作用，其機制與激活自噬相關，之后進一步試驗探究發現，其可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路，進而激活軟骨細胞自噬的發生而達到保護關節軟骨的作用?？滋鸬萚51]發現，單獨使用非甾體抗炎藥盡管可以改善造模小鼠的癥狀，但對軟骨細胞自噬水平無影響，而加用養血益腎方后，造模鼠軟骨中LC3表達水平得到提升且癥狀改善效果優于西藥，提示養血益腎方能夠通過調控軟骨細胞自噬發揮對關節軟骨的保護作用。以上眾多研究結果證實，中醫藥中諸多經典復方能夠通過影響自噬從而達到對關節軟骨的保護作用，見表1。

表1 中藥復方及單體調控軟骨細胞自噬治療骨關節炎

4 小結

綜上所述，自噬參與了骨關節炎的發生發展過程，以自噬為靶點治療KOA，是未來治療OA極具潛力的治療策略。基于目前研究可見，無論是單味中藥、中藥單體亦或是中藥復方，均可以通過不同的機制達到調控軟骨細胞自噬，從而防治骨關節炎的作用，但在諸多研究結果中我們可以發現存在著相互矛盾的結果，即自噬可以減少軟骨細胞凋亡，保護關節軟骨，但當出現過度自噬時，反而會加速細胞的死亡，進一步損傷關節軟骨，表現出自噬兩個相反方向的調節作用。因此，自噬在骨關節炎的進展過程中，究竟處于何種水平時發揮保護作用仍未能闡明，需在今后的研究中，對其進行更加深入的研究。同時，骨關節炎作為一種關節疾病，廣泛涉及關節及周圍組織病變，目前研究多局限在關節軟骨，尚缺乏對于關節軟骨下骨及滑膜等周圍組織的研究，需在今后的研究中對其進行多維度、深層次的探究?；谀壳暗奈墨I報道，中醫藥調控自噬防治骨關節炎的研究仍處于探索階段，機制仍有待進一步探索，期待今后更多中藥調控自噬發揮防治骨關節炎的作用機制得到揭示，為中醫藥臨床應用及新藥開發提供更加堅實充分的科學依據。