內質網應激蛋白激酶R樣內質網激酶和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白在甲亢性肌病中的作用*

黃雪梅，劉 麗，韋海濤，林媛媛△，盧德成

（1.南寧市第一人民醫院內分泌科，南寧 530022；2.廣西醫科大學附屬武鳴醫院內分泌科，南寧 530199）

甲狀腺功能亢進癥（甲亢），屬于內分泌系統常見病、多發病，是甲狀腺激素過多引起的臨床綜合征。而急性肌病是甲亢較少見的并發癥，起病急，臨床上可出現進行性肌無力，表現為飲水嗆咳、吞咽困難、發音障礙等，嚴重者會出現意識障礙、呼吸肌麻痹。在感染、手術和外傷等誘因下，易出現甲亢危象。若在急性甲亢性肌病的基礎上誘發甲亢危象，患者常在1～2 周內死亡[1-2]。急性甲亢性肌病臨床表現多樣，部分患者起病隱匿，部分患者以肌病為首發癥狀，部分患者肌病在甲亢癥狀出現一段時間后才出現，容易誤診、漏診[3-5]。內質網是細胞蛋白質合成、翻譯后折疊、加工、修飾和脂質代謝的重要細胞器，感應和調節細胞的應激反應。當細胞缺氧、營養能量缺乏或炎癥因子等刺激時，細胞穩態會被破壞，干擾蛋白質的折疊；未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網內腔中，引發未折疊蛋白質反應，觸發內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[6-8]。蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）是位于內質網的一種跨膜激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶腔結構域。在ERS狀態下，PERK能夠誘導CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/homologous protein，CHOP）的表達，介導細胞的凋亡[9-11]。本研究選取2020年2月至2021 年6 月在南寧市第一人民醫院初次診斷的急性甲亢性肌病患者進行分析，探討ERS 中PERK和CHOP 在急性甲亢性肌病中的作用，為急性甲亢性肌病的發病機制的研究提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020 年2 月至2021 年6 月在南寧市第一人民醫院初次診斷的急性甲亢性肌病患者21例，其中男2例，女19例，年齡15～50歲，平均（28.19±9.68）歲；單純甲亢患者30 例，其中男5 例，女25 例，年齡18～55 歲，平均（31.30±9.60）歲。同時，選取健康者25 例作為正常對照組，其中男3 例，女22 例，年齡17～48 歲，平均（33.32±9.64）歲。3 組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。病例納入標準：患者臨床表現及相關檢查結果符合甲亢及急性肌病的診斷標準[12-13]。排除標準：繼發性甲亢、妊娠；合并有糖尿病、高血壓、神經肌肉系統疾病、嚴重肝腎疾病、自身免疫性疾病、近期嚴重感染者。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床生化指標 采集研究對象空腹肘靜脈血5 mL，取3 mL 靜脈血檢測血清促甲狀腺激素（TSH）、游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素受體抗體（TRAb）。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）取研究對象空腹靜脈血2 mL，加入紅細胞裂解液，混勻后離心，棄上清液，留白細胞沉淀，加入NucleoZOL試劑（德國MN 公司）混勻，提取樣本總RNA，采用Prime Script?RT Master Mix 逆轉錄試劑盒（TaKaRa 大連公司）逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。采用SYBR Green?Premix Ex TaqTM II（TaKaRa大連公司）進行定量檢測分析。反應條件為：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火60 ℃34 s，40個循環，熔解曲線95 ℃30 s，60 ℃15 s。引物序列由上海生工生物工程公司合成。PERK上游引物為5’-CCAGTTTTGTACTCCAATTGCA-3’，下游為5’-CAGATACAGCTGGCCTCTATAC-3’；CHOP上游引物為5’-GAGAATGAAAGGAAAGTGGCAC-3’，下游為5’-ATTCACCATTCGGTCAATCAGA-3’；GAPDH上游引物為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游為5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。以GAPDH作為內參，mRNA的相對表達量采用2-△△CT法計算，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，各組樣本比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以頻數（n）或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用person相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標分析

急性甲亢性肌病組TRAb、FT4、FT3水平高于單純甲亢組和正常對照組（P＜0.01）；急性甲亢性肌病組TSH水平與單純甲亢組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患者外周血生化指標比較

表1 3組患者外周血生化指標比較

與急性甲亢性肌病組比較，aP＜0.01。

2.2 PERK、CHOP mRNA表達水平

急性甲亢性肌病組PERK、CHOPmRNA 表達水平高于單純甲亢組和正常對照組（P＜0.01），見表2。

表2 3組患者PERK和CHOP mRNA表達量比較

表2 3組患者PERK和CHOP mRNA表達量比較

與急性甲亢性肌病組比較，aP＜0.01。

2.3 相關性分析

在急性甲亢性肌病組中，TRAb 與PERK、CHOP mRNA表達水平呈正相關關系（r=0.898，P＜0.01；r=0.897，P＜0.01），與血清FT4、FT3水平無相關性（r=0.307，P=0.175；r=0.393，P=0.078）；血清FT4與PERK、CHOP mRNA 表達水平無相關性（r=0.362，P=0.106；r=0.303，P=0.182）；血清FT3與PERK、CHOP mRNA表達水平無相關性（r=0.356，P=0.113；r=0.414，P=0.062）,見圖1和圖2。

圖1 TRAb與PERK mRNA表達水平的相關性分析

圖2 TRAb與CHOP mRNA表達水平的相關性分析

3 討論

本研究結果顯示，急性甲亢性肌病患者TRAb、FT4、FT3水平比單純甲亢患者增高（P＜0.01）。朱少偉[5]研究亦發現，急性甲亢性肌病患者多有FT4、FT3明顯增高，TSH 降低。有研究報道，急性甲亢性肌病男性患者TRAb、FT4、FT3水平明顯高于單純甲亢組，而急性甲亢性肌病女性患者TRAb、FT4、FT3水平與單純甲亢組比較差異無統計學意義[4]。

目前，急性甲亢性肌病的發病機制尚不明確。急性甲亢性肌病是自身免疫性疾病，可能與延髓麻痹有關[14-15]；有研究表明，可能過多的甲狀腺激素激活細胞膜腺苷酸環化酶使細胞代謝增高，ATP 存儲減少，影響細胞的能量代謝[3,16]。當機體內環境發生改變，如能量代謝障礙、氧化應激和鈣離子穩態失衡等會觸發未折疊蛋白反應，從而觸發ERS。未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白累積激活PERK，進而磷酸化真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α），活化轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4），調控CHOP 的轉錄表達[17-18]。持續或過強的ERS 最終導致細胞凋亡，損傷機體功能，而CHOP 是ERS誘導細胞凋亡的特異性轉錄因子[10,19]。王丹等[20]研究發現，自身免疫性腦炎患者外周血T 淋巴細胞CHOP 的表達顯著升高，ERS 抑制自身免疫性腦炎患者T 淋巴細胞的增殖，促進細胞凋亡，ERS可能與自身免疫性腦炎發生有關。謝希等[21]研究顯示，PERK和CHOP在糖尿病大鼠的胰腺組織中表達水平明顯升高，提示ERS PERK 和CHOP 在糖尿病大鼠模型胰腺組織被激活。Jia等[22]研究發現，ERS可以促進平滑肌細胞的凋亡，從而促進主動脈炎癥的退化；在CHOP缺陷小鼠模型中，CHOP缺失可以防止胸主動脈瘤/夾層的形成和破裂。本研究結果顯示，急性甲亢性肌病組PERK、CHOPmRNA 表達水平高于單純甲亢組和正常對照組（P＜0.01），提示ERS中PERK、CHOP可能參與急性甲亢性肌病的發生、發展。

在ERS 過程中，機體的免疫系統、與壓力相關的通路均會受到影響。TRAb是甲狀腺內的淋巴細胞產生的特異性免疫球蛋白，TRAb 滴度水平對評價甲亢相關并發癥的風險、病情進展及預后有著重要意義[23-24]。TRAb 水平增加可以減弱甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸對甲狀腺濾泡上皮內cAMP的調節。有研究發現，ERS在機體產生免疫應答過中起著關鍵作用，免疫細胞具有較多的內質網和較高的蛋白質折疊活性，更易發生ERS[25-26]。本研究相關性分析發現，急性甲亢性肌病組TRAb 與PERK、CHOP mRNA表達水平呈正相關關系（P＜0.01），與血清FT4、FT3水平無相關性。劉曉相等[27]研究結果顯示，血清TRAb 滴度與TSH、FT4、FT3水平無相關性。一項甲亢合并浸潤性突眼的研究亦發現，血清TRAb 水平與FT4、FT3水平無相關性[28]。這與本研究急性甲亢性肌病組TRAb 與FT4、FT3水平無相關性的研究結果一致，而TRAb與PERK、CHOP mRNA表達水平呈正相關關系，提示TRAb 結合PERK、CHOP有利于早期判斷急性甲亢性肌病。

綜上所述，治療急性甲亢性肌病的關鍵在于早期診斷，以便及時治療。ERS 中PERK 和CHOP 可能參與急性甲亢性肌病的發生與進展過程，TRAb聯合PERK、CHOP 有利于早期判斷急性甲亢性肌病。