NADPH氧化酶介導的ROS在特發性炎性肌病動物模型骨骼肌組織中的表達及意義*

鄧蕊 柴克霞 馬苗

(青海大學附屬醫院風濕免疫科，青海 西寧 810001)

特發性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一種以肌無力和肌肉炎癥為特征的異質性疾病，包括多發性肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、免疫介導的壞死性肌病和抗合成酶綜合征[1-2]；其主要表現為肌無力、肌痛，出現特征性皮疹，血清肌酶水平升高，肌肉活檢顯示肌纖維變性和再生、慢性單核細胞浸潤及肌束周圍萎縮[3]。目前IIM發病機制仍不清楚，多認為是遺傳、環境、免疫機制和非免疫機制(內質網應激、活性氧的產生、自噬調節異常、缺氧、血管新生)等多因素相互作用的結果[3]。國內外多采用兔或豚鼠骨骼肌勻漿免疫誘導實驗性自身免疫性肌炎(Experimental autoimmune myositis,EAM)動物模型，其操作簡單、成本較低、建模效果好，為研究IIM提供了良好的基礎[4-5]。

鐵死亡是一種鐵依賴性的,以細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)累積為特征的調節性細胞死亡形式[6]。參與鐵死亡的ROS有多種產生來源，除了鐵介導的芬頓反應產生ROS外，依賴NADPH的NADPH氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOXs)和谷胱甘肽的耗竭同樣對ROS的產生起著重要作用[7]。活性氧為一系列分子氧的衍生物，主要包括非自由基(H2O2、ROOH、1O2、O3、HOCl、HOBr)和自由基(O2·-、·OH、ROO·、RO·)。適量的ROS可以促進細胞增殖、分化，參與細胞信號通路的調節；然而當ROS生成量超過機體調節能力時，則會引起炎癥反應、氧化應激，從而導致細胞生理功能紊亂，觸發細胞損傷或死亡[8]。研究表明，NOXs是體內ROS的重要來源，細胞通過依賴NADPH的電子還原系統將體內的氧分子還原成超氧陰離子，各種生長因子、細胞因子、炎癥介質等刺激均可活化NOXs，消耗NADPH，產生大量的ROS[9]。NOXs有7種亞型，分別是NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1及DUOX2，骨骼肌組織表達三種NOXs亞型(NOX1、NOX2和NOX4)，NOX1在骨骼肌組織中的生理作用尚未明確，NOX2和NOX4是骨骼肌組織中ROS的主要來源[10]。有研究報道當骨骼肌組織肌管中產生大量ROS時可導致炎癥細胞浸潤，線粒體功能障礙，進而發生肌肉收縮功能失調、肌無力[11-12]。NOXs介導的ROS已被證實參與了代謝性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、動脈粥樣硬化等的發生、發展過程[9，13]，而在IIM中的作用尚不清楚。本研究通過檢測EAM小鼠骨骼肌組織中NADPH、NOX2、NOX4和ROS的表達情況，探討NOXs中的NOX2和NOX4介導的ROS在IIM發生和發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 豚鼠與BALB/c小鼠均購自西安科奧生物科技有限公司，飼養于青海大學實驗動物中心，室內溫度保持在22℃～25℃，濕度50%左右，明暗交替周期為12 h，每兩日更換一次墊料以保持生存環境清潔干燥，每日添加飼料并更換清潔水。健康雌性豚鼠2只，體重300～350 g，用于制備豚鼠骨骼肌勻漿蛋白；健康雌性BALB/c小鼠7～8周齡，14只,體重18～22 g。本研究通過動物倫理委員會審核批準。

1.1.2 主要試劑 本研究中所選用的試劑及抗體購自南京建成生物工程研究所、武漢賽維爾生物科技有限公司及武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豚鼠骨骼肌勻漿蛋白的制備 5%水合氯醛麻醉豚鼠，在消毒條件下立即留取其四肢骨骼肌，冰浴條件下剔除神經、血管、筋膜等組織；稱重后放入4℃預冷的PBS液中，使用無菌外科剪剪碎組織，按每20 mg組織加入150 uL裂解液的比例加入裂解液，放置30 min，冰水浴中用刀式勻漿機5000 rpm進一步破碎組織，每勻漿30 s停30 s，反復多次，直至組織破碎成糊狀；用生理鹽水稀釋后經無菌紗布過濾，收集濾液，低溫離心機15000 rpm，4℃離心15 min，取上清液采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，用PBS液配置其終濃度為20 mg/mL，-80℃冰箱分裝保存備用。

1.2.2 建立EAM小鼠模型及分組 造模成功的判定方法 末次免疫處理一周后，通過觀察小鼠的臨床表現進行臨床評分、檢測小鼠四肢的肌力、測量小鼠體重、測定血清CK水平以及對小鼠四肢骨骼肌組織HE染色結果進行病理評級來判定造模是否成功。①臨床表現評分：觀察小鼠毛發的變化、姿勢的改變、聲音的轉變等。采用Lennon等[14]臨床表現評分方法：0分，無肌無力；1分，咬嚙/喊叫無力；2分，休息時體位隆起，頭下垂，前肢屈曲，行走震顫；3分，嚴重肌無力，無喊叫，體重減輕，嚴重的有肌肉萎縮、呼吸困難、瀕于死亡(表現居中者分別評分為0.5、1.5、2.5分)。②小鼠肌力測定[15]：用翻轉屏(一個50 cm2鐵絲網，由直徑為1 mm的金屬絲組成網眼大小為12 mm2的屏障)測定肌力，將小鼠放在該鐵絲網屏障中央，立即倒置屏障，使小鼠的頭部下降，屏障平穩地置于墊子上方約20 cm，秒表記錄小鼠掉落前持續的時間，每只小鼠連續測定5次，取平均值作為該小鼠的肌力測定值，時間越短提示肌力越差。③肌肉病理分級：依據Matsumoto等[16]肌肉組織HE染色病理學分級標準：0級，未發現病灶；1級，累及1～5個纖維；2級，累及6～30個纖維；3級，累及整個肌纖維束；4級，累及超過一個肌纖維束或整塊肌肉組織(1級記1分；肌肉病變居中者可增加0.5分)。由2名經驗豐富的病理專科醫師采用雙盲法對每只小鼠四肢的四塊肌肉組織的HE染色結果進行評分，取平均值作為每只小鼠的組織病理學得分。EAM組小鼠在背部脊柱旁、尾根部及左右后肢皮下多點注射免疫混懸液(0.25 mL豚鼠骨骼肌勻漿蛋白與0.25 mL完全弗氏佐劑的混懸液)，每周1次，連續注射6周，前三周免疫處理的同時腹腔注射百日咳毒素500 ng(用200 μL生理鹽水稀釋)。對照組小鼠在相同條件下相同部位注射同等劑量的對照混懸液(0.25 mL無菌生理鹽水與0.25 mL完全弗氏佐劑的混懸液)，每周1次，共注射6次。對照組6只，體重(20.25±1.29)g；EAM組8只，體重(20.48±1.13)g。兩組小鼠體重比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2.3 標本的采集與處理 ①血清標本：于末次免疫一周后，測量各組小鼠體重，按0.1 mL/10 g給予5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，經眼球取血，采血過程避免溶血，使用EP管留存1 mL，隨后低溫離心機3000 rpm，4℃離心10 min，離心后分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶(CK)水平。②肌肉標本：經眼球取血后，留取四肢骨骼肌，剔除神經、血管及筋膜，一部分組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、制片，用于免疫組織化學法檢測NOX2和NOX4及HE染色；另一部分組織立即置于液氮中冷凍數秒，隨后進行組織勻漿，用于分光光度法及ELISA法分別檢測NADPH和ROS。

1.2.4 HE染色檢測兩組小鼠骨骼肌組織病理改變 石蠟切片脫蠟脫苯至水，經蘇木素染色、鹽酸分化、伊紅染色后，脫水透明封片，光鏡下觀察骨骼肌組織病理改變。

1.2.5 分光光度法檢測兩組小鼠骨骼肌組織中NADPH的含量 稱取約0.1 g組織加入1 mL堿性提取液，冰浴研磨，95℃水浴5 min(蓋緊防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g 4℃離心10 min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4℃離心10 min，取上清，嚴格按照說明書測定步驟加入試劑，混勻，波長570 nm，光徑1 cm，雙蒸水調零測定樣本吸光值，代入公式計算NADPH含量。

1.2.6 免疫組織化學法檢測兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2和NOX4的表達 石蠟切片常規脫蠟至水；滴加3%H2O2，37℃濕盒孵育10 min；PBS緩沖液洗3次，每次5 min；擦干，浸入0.01 mol枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中高壓鍋煮沸15 min；室溫冷卻后重復步驟三，擦干，滴加5%BSA封閉液，37℃濕盒孵育30 min；甩干勿洗，滴加一抗工作液，4℃濕盒孵育過夜；移去一抗，重復步驟三，擦干，滴加二抗工作液，37℃濕盒孵育30 min，重復步驟三；擦去多余PBS液，滴加新鮮配制DAB工作液，鏡下監測染色程度，蒸餾水洗3次，每次5 min；擦干，蘇木素復染，蒸餾水沖洗；1%鹽酸酒精中分化數秒，蒸餾水沖洗；常規脫水、透明、干燥、封片。顯微鏡下觀察，每張切片先在低倍鏡(100×)下選取細胞密集區域，再用高倍鏡(400×)拍照，隨機選擇10個視野，陽性染色呈淡黃色、棕黃色或棕褐色，計算陽性著色細胞占比，NOX2及NOX4主要表達在胞膜及胞漿[17]。反應結果的判斷標準參照許良中[18]標準，首先將染色強度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再將陽性細胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。根據兩項評分乘積進行免疫組織化學染色評分，每張切片的得分取10個視野的平均分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>3分才算免疫反應陽性。

1.2.7 ELISA法檢測兩組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量 稱取約0.1 g組織加入0.9 mLPBS，冰浴條件下使用勻漿器將標本充分勻漿，低溫離心機5000rpm，4℃離心15 min，收集上清液，分裝后一份待檢測，其余-20℃冷凍備用。

2 結果

2.1 EAM小鼠模型造模成功的結果判定 造模過程中對照組小鼠無死亡；EAM組有2只小鼠死亡，其中1只死于第4次免疫處理次日，另1只死于第5次免疫處理后2 h，其余小鼠均順利完成造模過程。

2.1.1 小鼠臨床表現、臨床評分及體重變化 對照組小鼠活動姿勢正常，叫聲響亮，進食良好，體重穩定増長。其中有2只小鼠在第3次注射后，背部出現直徑約0.3～0.5 cm的不規則區域毛發脫落，未出現硬結、紅腫、破潰等現象，其余小鼠毛發整齊有光澤，未出現脫毛等現象。對照組小鼠臨床評分為0分。EAM組小鼠在第2次免疫注射后背部注射部位出現毛發脫落，其中2只小鼠背部出現0.2～0.3 cm的硬結；第3次注射后，全部小鼠背部注射部位出現硬結、紅腫，此時出現肌無力的表現，行走時后肢拖杳；第4次注射后，注射部位出現紅腫、破潰現象，全部小鼠毛發凌亂、無光澤，進食減少，體重增長減慢或不増長，休息時背部隆起，其中一只小鼠出現嚴重的肌肉萎縮、呼吸急促、進食費力等癥狀，于次日死亡；第5次注射后，小鼠背部出現多個硬結，多個注射部位均有脫毛、破潰、流膿現象，叫聲嘶啞，行走拖沓，直立困難，其中一只小鼠2 h后死亡；第6次注射后，小鼠背部大片的毛發脫落，破潰流膿現象嚴重，活動能力明顯下降或不活動，進食費力，呼吸急促，見圖1。EAM組小鼠臨床評分為2.0～3.0分，平均(2.33±0.41)分。與對照組相比，末次免疫后1周EAM組小鼠體重下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 兩組小鼠臨床表現

2.1.2 小鼠肌力測定時間及血清CK水平 EAM組小鼠肌力測定時間較對照組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；EAM組小鼠血清CK水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.1.3 小鼠骨骼肌組織病理改變及病理學評分 兩組小鼠骨骼肌組織HE染色圖見圖2。對照組小鼠骨骼肌肌纖維大小、形態、結構基本正常，有少量炎性細胞浸潤，未見肌纖維萎縮、變性、壞死。EAM組小鼠骨骼肌肌纖維大小不一、粗細不等，有大量炎性細胞浸潤，可見不同程度萎縮、變性、壞死。EAM組小鼠骨骼肌組織病理學評分顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。根據造模成功的判定標準，本研究成功建立EAM小鼠動物模型。

表1 兩組小鼠的體重、肌力測定時間、血清CK水平及骨骼肌組織HE染色評分結果比較

2.2 小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽性表達率 EAM組小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽性表達率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的陽性表達率結果[n(×10-2)]

2.3 小鼠骨骼肌組織中NOX2及NOX4的免疫組化評分 兩組小鼠骨骼肌組織中NOX2與NOX4的免疫組化結果見圖2。NOX2和NOX4在EAM組小鼠骨骼肌組織中的免疫組化評分高于對照組(P<0.05)，見表3。

圖2 兩組小鼠骨骼肌組織HE染色圖及NOX2與NOX4免疫組化圖(400×)

2.4 小鼠骨骼肌組織中NADPH和ROS的含量 與對照組相比，EAM組小鼠骨骼肌組織中NADPH含量明顯降低，ROS含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組小鼠骨骼肌組織中NADPH、ROS的含量及NOX2、NOX4免疫組化評分結果比較

2.5 相關性分析Pearson相關分析顯示，EAM組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量與NOX2、NOX4的免疫組化評分均呈正相關，而與NADPH的含量呈負相關(P<0.05)；EAM組小鼠骨骼肌組織HE染色病理學評分與NOX2、NOX4的免疫組化評分及ROS的含量均呈正相關，而與NADPH的含量呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 EAM組小鼠骨骼肌組織中有關指標的相關性分析

3 討論

研究證實，IIM的發病與許多特定的環境危險因素如細菌、病毒、寄生蟲感染，職業性接觸灰塵、氣體或煙霧，紫外線照射等有關[19]。此外在IIM的發病過程中會產生大量活化的補體、致病性的自身抗體、免疫復合物及細胞因子等[20]；其次，有研究顯示，缺氧及血管新生也參與了IIM的發病過程[20-22]。血管新生可能是對缺氧環境做出的適應性調節，血管內皮生長因子(VEGF)是一種常見的促血管生成因子，通過與受體(VEGFR)結合上調相關基因的轉錄水平，誘導血管新生，而VEGF與VEGFR的結合亦可通過激活亞基Rac進而激活NOXs[23]。有文獻報道NOXs是體內重要的敏感性氧感受器，在缺氧條件下也可通過促進VEGF的表達來促進血管生成，VEGF和NOXs可以相互促進彼此間的表達或激活[23-24]。本研究認為在EAM小鼠體內這些異常的刺激因素可能激活了NOXs，使得EAM小鼠骨骼肌組織中NOX2和NOX4的表達水平升高，而高表達的NOX2和NOX4介導生成高濃度的ROS，大量的ROS可降低細胞呼吸速率并減少ATP的產生，造成細胞內能量不足、線粒體功能障礙及關鍵肌肉組分的損傷，從而誘導骨骼肌組織萎縮及功能喪失，并參與維持骨骼肌組織的炎癥進展。

NADPH是細胞內抗氧化防御系統不可或缺的組成成分，在細胞防御ROS氧化性損傷方面起著重要作用[25]。有研究發現，細胞內NADPH的水平是鐵死亡敏感性的生物標志，在鐵死亡發生過程中，NADPH的水平降低，而高水平的NADPH則會抵抗鐵死亡的發生[26]。鐵死亡的發生需要一定水平的NADPH作為電子供體，產生ROS；而在鐵死亡發生過程中，NADPH提供了電子被還原成NADP++H+，因此NADPH的水平下降；正常生理情況下，NADPH的分解與合成處于相對平衡狀態，而在炎癥、疾病等條件下，NADPH更傾向于在NOXs的作用下產生ROS，誘發鐵死亡[27]。本研究認為在EAM小鼠體內NADPH一方面被消耗，用于產生ROS誘導鐵死亡，并且NOXs活化越多，NADPH消耗越多，隨之生成的ROS水平越高；另一方面，NADPH還可以被高水平的ROS氧化，從而造成NADPH含量進一步降低。而對照組小鼠相比于EAM組小鼠，體內的炎癥介質、細胞因子、抗體補體等成分較少，因此NOXs可能處于靜息狀態，從而NADPH的水平處于氧化還原平衡狀態，ROS的含量也維持在生理水平。

有文獻報道，在疾病狀態下，NOX2參與了肌營養不良、肌纖維萎縮和收縮功能障礙的病理生理學進展[11，28]，NOX4介導產生的超氧化物通過過氧亞硝酸鹽和瞬時受體電位陽離子通道等機制誘發骨骼肌肥大[29]；其次，活化后的NOX2和NOX4，通過消耗NADPH，介導產生大量ROS，高濃度的ROS可直接作用于脂質、DNA和蛋白質等生物大分子，造成脂質過氧化、誘導基因突變和蛋白質變性，除此以外，還可損傷線粒體、內質網及溶酶體等重要細胞器的功能，激活NF-κB信號通路，導致細胞內的氧化損傷及炎癥反應，誘導鐵死亡發生[30]；再次，炎癥反應、受損的生物大分子及細胞器介導產生的細胞因子與炎癥因子又會進一步激活NOX2和NOX4，生成更多的ROS，對ROS的產生發揮正反饋作用并引發氧化損傷級聯反應及炎癥級聯反應，同時誘導細胞鐵死亡反應程度愈加強烈。因此在EAM小鼠骨骼肌組織中，NOX2/NOX4的表達水平越高，NADPH被大量消耗，ROS的含量越多，細胞鐵死亡反應越強，體內氧化還原反應嚴重失衡，骨骼肌組織炎癥反應越顯著、損傷程度越嚴重。本研究發現EAM組小鼠骨骼肌組織中NOX2、NOX4的表達及ROS的含量均較對照組升高，而NADPH的含量較對照組降低；與此同時，本研究還發現EAM組小鼠骨骼肌組織中ROS的含量與NOX2、NOX4的免疫組化評分均成正相關，而與NADPH的含量成負相關；此外，EAM組小鼠骨骼肌組織HE染色病理學評分與NOX2、NOX4的免疫組化評分及ROS的含量均成正相關，而與NADPH的含量成負相關。以上結果提示鐵死亡相關的NOXs介導的ROS可能參與了IIM的發病過程，并在IIM肌肉組織的損傷中發揮重要作用。

NOXs介導的ROS可能通過鐵死亡途徑參與了IIM的發病過程，并且NOXs可能是通過消耗NADPH產生大量的ROS，導致組織細胞的氧化性損傷并誘導鐵死亡反應來參與IIM的發病。這為深入研究IIM的發病機制提供了新的方向。但是由于IIM的發病機制相對復雜，且本研究樣本量較小，故還需擴大樣本量并增加NOX2、NOX4和ROS的抑制劑進一步研究探討NOXs介導的ROS在IIM發病機制中的作用及意義。

4 結論

NADPH氧化酶中的NOX2和NOX4可能通過消耗NADPH產生大量的ROS，導致組織細胞的氧化性損傷并誘導鐵死亡反應來參與IIM的發病。NADPH、NOX2、NOX4和ROS有望成為新的評價IIM肌肉組織損傷程度的指標。