抑制趨化素樣因子1對變應性鼻炎白細胞介素-9表達和嗜酸性粒細胞的影響*

張峻崢 時文杰 謝偉偉 李海亮 樊宏

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院耳鼻咽喉科，海南 ?？?570208)

變應性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一種變應原引起的IgE介導的免疫反應相關鼻黏膜炎癥[1]。AR患者通常以鼻腔阻塞、鼻漏、打噴嚏和鼻癢等癥狀為主要特征，給患者帶來了沉重負擔，嚴重影響其知覺和認知功能。如今，AR已成為影響全球10%～20%成年人的重要公共衛生問題[2-4]。AR由吸入的過敏原包括塵螨、花粉和動物皮屑等引起，而且一些AR患者對抗組胺藥和皮質類固醇不敏感，長期使用會產生一系列不良反應[5]。趨化素樣因子1(Chemokine like factor-1，CKLF1)是一種新穎的細胞趨化因子，具有獨特結構和多種活性，包含趨化因子家族趨化因子所具有的兩個連續的半胱氨酸[6]。已有研究表明，CKLF1與變應性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、心腦血管疾病等均有重要聯系[7-8]。本研究通過構建大鼠AR模型，使用CKLF1拮抗肽C19抑制CKLF1的表達，旨在探討干預CKLF1對AR大鼠體內IL-9及嗜酸性粒細胞的影響，為AR的臨床診治研究提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，3～4周齡，體質量200～220 g。飼養環境：溫度(25.0±0.5)℃、相對濕度40%～60%、光暗周期12 h/12 h交替，所有大鼠適應性喂養1周后進行實驗。本研究通過動物倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑 CKLF1拮抗肽C19購于醫學免疫國家重點實驗室，丙酸氟替卡松(FP)購于葛蘭素史克制藥(重慶)有限公司，卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁[Al(OH)3] 購于美國Sigma公司，特異性ELISA IL-9、IgE、IFN-γ試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司，HE染色試劑盒和免疫組織化學染色試劑盒購于武漢博士德生物公司，RNAiso Plus試劑、逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR檢測試劑盒購于日本Takara公司，瑞氏染色試劑液、BCA蛋白檢測試劑盒和ECL發光液購于上海碧云天生物研究所，兔抗MBP單抗隆抗體(貨號ab7349)、兔抗ECP單克隆抗體(貨號ab207429)、兔抗EPO單克隆抗體(貨號ab275686)、兔抗GAPDH多克隆抗體(貨號ab9485)及兔抗IL-9多克隆抗體(貨號ab233706)購于英國Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模 選擇SD大鼠建立變應性鼻炎(AR)動物模型，依據參考文獻方法[9]，第一步為基礎致敏：分別取0.3 mg的OVA與30 mg的[Al(OH)3]，加入1 mL生理鹽水將兩者混勻成混懸液，通過大鼠腹腔注射，隔日注射1次，共注射7次，對照組同時注射等量生理鹽水；第二步為鼻腔激發：取50 μL的2%OVA滴鼻致敏后的大鼠，以微量進樣器從雙側鼻腔滴入，每天1次，連續7天，對照組滴入等量生理鹽水。

1.3.2 分組與藥物處理 將40只大鼠按照數字隨機表法分為4組，包括對照組、模型組、CKLF1抗體組(AR+CKLF1-C19組)、丙酸氟替卡松組(AR+FP組)，每組10只。除對照組外，其余3組大鼠均構建AR模型，CKLF1抗體組AR激發前連續10天分別在雙側鼻腔滴5 μL CKLF1-C19肽干預，丙酸氟替卡松組AR激發前連續10天分別在雙側鼻腔滴5 μL丙酸氟替卡松噴霧劑干預，對照組和模型組均同時在雙側鼻腔滴5 μL的生理鹽水。

1.3.3 變應性鼻炎癥狀評分 末次鼻腔激發后，各組大鼠均進行表觀行為學評分，觀察30 min內大鼠噴嚏、鼻溢和搔鼻動作行為，以疊加量化計分。具體評分：噴嚏，1～4個，1分；5～10個，2分；10個以上，3分；流鼻涕，流至鼻孔前，1分；流出鼻孔，2分；流至面部，3分；撓癢：單前肢偶有撓鼻，1分；雙前肢撓鼻，2分；雙前肢不停撓鼻，3分。

1.3.4 ELISA法檢測IL-9、IgE、INF-γ水平 各組大鼠禁食過夜，10%水合氯醛腹腔注射將其麻醉，腹主動脈采集血液，室溫靜置2 h，4℃低溫離心機上以4000 r/min離心15 min，獲取上清液，特異性ELISA試劑盒檢測血清中IL-9、IgE、IFN-γ的水平，在酶標儀波長450 nm處檢測各樣品的OD值。

1.3.5 HE染色檢測大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞數 采血后處死各組大鼠，分離取出雙側鼻腔黏膜組織，清洗干凈后，在4%多聚甲醛中固定過夜。取固定好的組織，石蠟包埋，切成5 μm厚的組織切片，進行蘇木精-伊紅染色。切片脫蠟脫水，加入蘇木精染色5 min，流水沖洗，加入伊紅染色3 min，流水再次沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干，光學顯微鏡下觀察鼻腔黏膜組織形態并捕獲圖像，隨機選擇5個不同視野計數嗜酸性粒細胞數目，結果取平均值。

1.3.6 瑞氏染色檢測大鼠鼻腔分泌物嗜酸性粒細胞數目 取各組鼻腔分泌物，均勻輕薄地涂抹在載玻片上，自然干燥，滴加瑞氏染液染色于涂片上，使標本被染色液覆蓋，接著滴加等量的磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)，輕輕晃動玻片，靜置5 min，自來水沖洗干凈，晾干，光學顯微鏡下觀察嗜酸粒細胞并捕獲圖像，隨機選擇5個不同視野計數嗜酸性粒細胞數目，結果取平均值。

1.3.7 免疫組織化學染色檢測鼻黏膜組織IL-9表達 取鼻腔黏膜組織石蠟切片，脫蠟脫水，置于0.3%過氧化氫中孵育30 min阻斷內源性過氧化物酶，微波爐高溫(98℃)加熱5 min修復抗原，加入10%山羊血清室溫孵育1 h，接著將切片與兔抗鼠IL-9多克隆抗體(1∶400)在4℃下共同孵育過夜，次日，棄一抗液，PBS清洗，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)，室溫孵育1 h，PBS清洗，滴加 DAB 于切片上顯色，自來水清洗干凈，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干，光學顯微鏡下觀察組織中蛋白陽性表達并捕獲圖像，隨機選擇5個視野，胞膜和胞漿內黃色至棕色為陽性染色，Image-Pro Plus軟件分析計算陽性表達面積。

1.3.8 實時熒光定量PCR檢測大鼠鼻黏膜組織MBP、ECP、EPO表達 無菌環境下剪碎鼻腔黏膜組織，加液氮研磨，RNAiso Plus試劑提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度、濃度，根據逆轉錄試劑盒操作合成cDNA，并以cDNA為模板，按照實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書，并通過實時熒光定量PCR系統進行擴增實驗，檢測基因的mRNA表達水平，β-Actin作為內參基因。擴增條件設置：95℃ 5 min(循環1次)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，循環40次，采用2-ΔΔCt法計算基因的mRNA相對表達水平。引物序列：MBP正義鏈5′-TGATGTGTTTG GGGAGGCAGA-3′，反義鏈5′-AACCCATAGTTCC TCTACGCC-3′；ECP正義鏈5′-ATCACTCATCTG CCAAGC-3′，反義鏈5′-CAGGGTTCACAAGGGAC T-3′；EPO正義鏈5′-TGGAAAGAGGCGTAATGG-3′，反義鏈5′-AAGGATGTAAGTGCGTTGAT-3′；β-Actin正義鏈5′-GAGACCTTCAACACCCAGC-3′，反義鏈5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。

1.3.9 Western blot檢測鼻腔黏膜組織抗MBP、ECP、EPO蛋白水平 將鼻腔黏膜組織在無菌環境下剪碎研磨勻漿，加入預冷的RIPA緩沖液提取組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品，將其與5×Loading buffer 混合，通過10% SDS-PAGE分離蛋白質2 h，電轉移至PVDF膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，膜上加入兔抗MBP、ECP、EPO多克隆抗體，均按1∶1000稀釋，在4℃下共同孵育過夜；次日，棄一抗液，TBST洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST再次洗膜，滴加ECL顯色，凝膠成像系統拍照，Image-ProPlus軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參蛋白，蛋白相對表達量記為目的蛋白條帶/GAPDH條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠表觀行為學評分比較 對照組大鼠未見打噴嚏、流涕，偶有抓鼻；模型組大鼠出現打噴嚏、流涕以及頻繁抓鼻的現象，且煩躁不安，行為學評分高于5分，較對照組顯著升高(P<0.05)，由此說明AR模型構建成功。與模型組比較，AR+CKLF1-C19組和AR+FP組大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻行為均減少，行為學評分較模型組均顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學評分比較分)

2.2 各組大鼠血清IL-9、IgE及IFN-γ水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-9、IgE水平顯著升高，IFN-γ水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，AR+CKLF1-C19組和AR+FP組大鼠血清中IL-9、IgE水平顯著下降，而IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 ELISA檢測各組大鼠血清IL-9、IgE及IFN-γ水平

2.3 各組大鼠HE染色結果 HE染色結果顯示，對照組大鼠鼻黏膜結構完整，未見損傷，偶見嗜酸性粒細胞；模型組鼻黏膜水腫，黏膜層增厚，黏膜上皮脫落，嗜酸性粒細胞及其他炎癥細胞浸潤明顯，嗜酸性粒細胞數目較對照組顯著增加(P<0.05)；AR+CKLF1-C19組和AR+FP組鼻黏膜水腫及炎癥細胞浸潤減輕，嗜酸性粒細胞數目均較模型組顯著減少(P<0.05)，見圖2。

圖2 HE染色檢測各組大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞數目

2.4 各組大鼠瑞氏染色結果 瑞氏染色結果顯示，對照組大鼠的鼻腔分泌物及下鼻甲黏膜刮片涂片可見少量的嗜酸性粒細胞；模型組內可見大量的嗜酸性粒細胞，數目較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，AR+CKLF1-C19組和AR+FP組內嗜酸性粒細胞數顯著減少(P<0.05)，見圖3。

圖3 瑞氏染色檢測鼻腔內嗜酸性粒細胞表達

2.5 各組大鼠鼻黏膜組織IL-9表達比較 免疫組織化學染色結果顯示，對照組大鼠鼻黏膜組織內黃色至棕色染色少，IL-9陽性表達低；模型組內可見大量明顯的黃色至棕色染色，顏色較深，IL-9陽性表達較對照組顯著升高(P<0.05)；AR+CKLF1-C19組和AR+FP組內黃色至棕色染色變淺，IL-9陽性表達均較模型組顯著下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 免疫組織化學染色檢測鼻黏膜組織IL-9表達

2.6 各組大鼠鼻黏膜組織MBP、ECP、EPO表達比較 實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織MBP、ECP、EPO mRNA相對表達量顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，AR+CKLF1-C19組和AR+FP組鼻黏膜組織MBP、ECP、EPO mRNA相對表達量均顯著下調(P<0.05)，見圖5。Western blot檢測結果顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織MBP、ECP、EPO蛋白相對表達量較對照組顯著上調(P<0.05)；而AR+CKLF1-C19組和AR+FP組鼻黏膜組織MBP、ECP及EPO的蛋白相對表達量均較模型組顯著下調(P<0.05)，見圖6。

圖5 實時熒光定量PCR檢測各組大鼠鼻黏膜組織內MBP、ECP、EPO的mRNA表達

圖6 Western blot檢測各組大鼠鼻黏膜組織內MBP、ECP、EPO的蛋白表達

3 討論

AR是一種在世界范圍內普遍流行的疾病，并且患病率呈持續上升趨勢；盡管AR并不威脅生命，但對人們的生活質量產生了負面影響[2]。在變應性鼻炎患者中，變應原進入引起I型超敏反應，其主要作用是IgE抗體、肥大細胞、組胺、細胞因子與免疫細胞之間相互作用進一步誘發的炎癥反應[4]。作為一種嚴重程度不一的異質性疾病，盡管對AR的病理和治療機制進行了廣泛研究，但仍有許多方面不清楚。目前，AR的藥物治療主要是對癥治療，其目的是減輕相關癥狀。除了回避變應原，在AR治療中使用藥物取決于疾病的嚴重程度：在輕度或間歇性情況下，患者通常采用口服或鼻用第二代抗組胺藥或鼻內皮質類固醇激素；在中度至重度條件下，通常使用包括白三烯拮抗劑和抗膽堿能藥在內的其他藥物作為抗組胺藥或鼻內皮質類固醇激素的補充療法，并使用其他一些藥物，例如肥大細胞穩定劑和抗IgE單克隆抗體[10-11]。然而，目前藥物療法的主要局限性在于其有益作用不會長時間持續，在停止用藥時便會出現癥狀，并且會產生一定的副作用。因此，迫切需要鑒定和探索藥物的特異性新靶標，以提高臨床上AR的治療效果。

細胞因子是由免疫細胞或其他細胞合成或分泌的小分子肽，機體內許多細胞因子之間相互促進或抑制，形成了復雜的細胞因子調節網絡。細胞因子在宿主防御機制中起著至關重要的作用，通常被認為是分泌的“信使”蛋白，通過調節增殖和分化來調節免疫功能[12]。越來越多的證據表明，在一定條件下各種免疫介導性疾病的發生和發展涉及細胞因子的參與。CKLF1是在使用植物血凝素刺激后從U937細胞中分離出的趨化因子新成員，定位于染色體16q 22.1，由4個外顯子和3個內含子組成，具有廣泛的生物活性，除了具有趨化活性外，還對許多細胞如人骨髓細胞具有明顯的促增殖和分化作用，并可以刺激人造血干細胞的集落形成，增加粒細胞-單核細胞集落形成單位的增殖[13-14]。目前，關于CKLF1在過敏性疾病中的研究也在不斷增加，例如特應性皮炎患者血清和皮膚中CKLF1水平均升高，并且CKLF1在特應性皮炎患者的皮膚病變中也呈現過表達[15]；在AR患者的鼻黏膜組織中檢測到CKLF1的轉錄水平和蛋白水平均增強[16]；此外，CKLF1還參與了一些自身免疫性疾病過程，例如狼瘡性腎炎和關節炎[17-18]。已知C19肽能夠通過介導趨化因子受體從而對趨化性產生一定的抑制作用，針對鼻內和腹膜內的過敏癥狀，使用其治療均可達到與布地奈德較一致的效果[19]。本研究結果同樣顯示，在AR激發前連續10天分別在雙側鼻腔滴入C19肽干預可明顯減輕大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等行為，以及鼻黏膜組織水腫、黏膜層增厚等病理現象。因此推測，CKLF1可能是治療AR的有效靶標。

IL-9屬于IL-2Rγc鏈家族成員，是一種多功能的細胞因子，可以調節多種細胞功能，起初被確定為T細胞和肥大細胞的生長因子[20]。IL-9主要參與過敏性疾病、自身免疫性疾病和炎癥疾病的發展，此外，其還能夠直接影響腫瘤細胞的存活，或者間接地通過激活肥大細胞和招募樹突狀細胞參與腫瘤免疫過程[21]。IgE是過敏性反應的關鍵免疫介質，而IgE介導的超敏反應可能是過敏原引起AR發生的機制，因此，IgE是臨床上AR診斷鑒別的指標之一。IFN-γ是由Th1細胞分泌的細胞因子，能夠拮抗IgE介導的反應。本研究結果顯示，在AR激發中抑制CKLF1能夠降低血清和鼻黏膜組織中IL-9表達，同時抑制IgE表達，提高IFN-γ水平。

嗜酸性粒細胞不僅在嗜酸性粒細胞相關疾病的發病機理中起關鍵作用，而且還具有多種重要的生物學功能，包括維持體內平衡，宿主抵抗感染，通過規范Th1/Th2平衡進行免疫調節以及消炎和抗腫瘤活性[22]。嗜酸性粒細胞浸潤是AR的特征之一，由T細胞、上皮細胞和肥大細胞產生的趨化因子能夠將嗜酸性粒細胞募集到鼻黏膜組織。嗜堿性粒細胞脫粒是AR早期反應的關鍵機制，從血液滲入組織后也參與AR的后期反應[23]。此外，嗜酸性粒細胞能夠合成并表達多種細胞因子，在AR炎癥反應中發揮重要作用[24-25]。本研究結果顯示，AR大鼠的鼻黏膜中嗜酸性粒細胞浸潤明顯，MBP、ECP及EPO 的表達明顯上調，而在AR激發中抑制CKLF1顯著改善了嗜酸性粒細胞浸潤的現象，同時降低了組織內MBP、ECP及EPO 的表達。

4 結論與啟示

抑制CKLF1能夠通過降低變應性鼻炎大鼠血清和鼻黏膜組織內IL-9表達以及嗜酸性粒細胞浸潤，從而改善變應性鼻炎大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻的行為，減輕鼻黏膜組織水腫和黏膜層增厚的現象。但作用的確切機制有待深入探究，以期為變應性鼻炎的診治提供更明確的思路。