血管生成因子VEGF及sflt-1在子宮內膜異位癥中的表達及意義

鄭萍萍，王小紅

（1.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院婦產科，福建 福州 350004）

0 引言

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMT）是臨床常見的婦科疾病，指在子宮體以外的部位出現了子宮內膜組織（腺體和間質）的種植生長，以進行性加重的痛經、月經異常、不孕及性交不適為主要癥狀，對婦女的生活質量產生嚴重的影響[1]。育齡期是EMT的高發時段，近年來發病率呈持續上升的狀態。對于EMT的現代學發病機制，大多數學者認可和支持Sampson提出的經血逆流種植學說。同時，郎景和提出的發病三部曲“AAA模式”，要完成黏附（Attachment）-侵襲（Aggression）-血管形成（Angiogenesis），內膜細胞必須通過腹水、腹腔細胞和腹膜細胞外基質的3道防線，是對經血逆流種植學說的分子生物學機制的補充和完善[2]。血管生成在該發病模式中的關鍵環節。研究顯示，血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）及 其 受 體VEGFR（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor）是一組已知擁有最強促進血管生成作用及對內皮細胞最高特異性的血管生成信號通路，可以促進血管生成和內皮細胞增生[3,4]。血管內皮生長因子可溶性受體（Soluble fms-like tyrosine kinase-1，sflt-1）為VEGF的 受體之一，與VEGF具有高度的親和力。

目前腹腔鏡下見到異位病灶和病灶組織的病理活檢是本病診斷的依據，但是，活檢組織的病理報告陰性，并不能成為異位病灶的診斷的排除條件。對于EMT，如今還缺乏高敏感度的臨床檢測方法，也缺乏特異性的無創生物學標志物。本課題通過檢測血管生成因子VEGF及其受體sflt-1在兩組患者中的水平，分析其在兩組中表達的差異；探究血管生成因子VEGF及其可溶性受體sflt-1在EMT中的表達及意義，以尋找無創的生物學檢測方法，為疾病的早期診治及疾病的預防和隨訪提供有效的簡易方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2021年1月期間，在福建中醫藥大學附屬人民醫院婦科病房住院的患者，其中行腹腔鏡手術，術后病理確診EMT的患者60例（實驗組）；行腹腔鏡切除子宮，術后病理診斷排除EMT及子宮腺肌病患者60例(對照組)；共120例。兩組的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組具有可比性。見表1。

表1 兩組患者的年齡情況比較（±s）

組別 例數 最小年齡（歲） 最大年齡（歲） 平均年齡（歲) Z值 P值對照組 60 36 50 42.22±2.731 -1.621 0.105實驗組 60 34 51 41.43±4.496

1.1.1 診斷標準

西醫診斷標準：參照第9版婦產科學[1]及2015年子宮內膜異位癥的診治指南[5]。

1.1.2 納入標準

均經術后病理確診；月經規律，且術前3個月內未使用激素類藥物治療者；同意參加本次實驗研究并簽署知情同意書。

1.1.3 排除標準

不符合診斷標準；術前3個月使用激素類藥物治療者；子宮內膜病變、惡性腫瘤及癌前病變患者；近期有燒傷、燙傷、挫傷等皮膚大面積損傷，可能影響實驗結果的病史者。

1.2 研究方法

1.2.1 標本的采集及保存

血清：兩組患者，于術前月經干凈后2-3天的清晨，空腹抽取5mL靜脈血（肘部），常溫下靜置1h，轉速3000 r/min下離心20min，將上清液置于凍存管中，并保存在-80℃的條件下待檢，避免反復凍融。內膜組織：實驗組為腹腔鏡術中取異位內膜組織(異位內膜囊腫壁組織)，對照組為子宮切除術后取子宮內膜組織，組織置于有RNA保護液的凍存管中，-80℃的條件下保存待檢，避免反復凍融。

1.2.2 檢測方法

（1）ELISA方法檢測血清中VEGF及sflt-1的水平

采用人血管內皮細胞生長因子(VEGF)試劑盒（MM-0115H1，酶免）和人可溶性血管內皮生長因子受體1(sflt-1)試劑盒（MM-1900H1，酶免），采用全自動酶標儀（WD-2102B，六一）進行檢測，實驗檢測嚴格按照試劑盒說明書進行，通過檢測得到OD值和標準物的濃度，得出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式得出樣品濃度。

（2）Real-time PCR方法檢測內膜組織中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表達

采用超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO，康為世紀）對內膜組織中的mRNA進行提取，用紫外分光光度儀對RNA濃度、純度進行測定，用5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ進行逆轉錄反應，采用2×SYBR Green PCR Master Mix進行擴增，采用CFX Connect?實時熒光定量PCR儀進行擴增反應和熒光定量；繪制出熔解曲線和擴增曲線，運用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.2.3 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析，以P＜0.05差異有統計學意義。計量資料以（±s）表示，兩組計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布兩組間比較采用t檢驗，不符合正態分布兩組間比較采用秩和檢驗；多組計量資料采用單因素方差分析；計數資料采用卡方檢驗；兩變量相關性采用直線相關分析。

2 結果

2.1 VEGF、sflt-1在兩組患者術前血清中的表達

兩組患者術前血清中VEGF水平經非參數檢驗，結果顯示兩組有差異，實驗組患者血清中VEGF水平高于對照組，差異有統計學意義，P＜0.05；兩組患者術前血清中sflt-1水平經獨立樣本t’檢驗，結果顯示兩組有差異，實驗組患者血清中sflt-1水平高于對照組，差異有統計學意義，P＜0.05，見表2。

表2 兩組患者術前血清中VEGF及sflt-1表達情況 比較(±s)

表2 兩組患者術前血清中VEGF及sflt-1表達情況 比較(±s)

組別 例數 VEGF（pg/mL） sflt-1（pg/mL）實驗組 60 94.74±19.976 1401.29±272.31對照組 60 52.17±12.507 784.38±92.198 P值 ＜0.05 ＜0.05

2.2 VEGF mRNA、sflt-1 mRNA在兩組患者內膜組織中的表達

兩組患者內膜中VEGF mRNA及兩組內膜中sflt-1 mRNA的相對表達量分別經非參數檢驗，結果均顯示兩組有差異，實驗組異位內膜組織中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表達均高于對照組，差異有統計學意義，P＜0.05，見表3。

表3 兩組患者內膜組織中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表達情況比較（±s）

表3 兩組患者內膜組織中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表達情況比較（±s）

組別 例數 VEGF mRNA sflt-1 mRNA實驗組 60 3.08±1.554 1.50±0.719對照組 60 1.35±1.157 1.12±0.507 Z值 6.477 2.520 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

EMT雖然有著良性的形態學表現，但又有著類似惡性腫瘤的侵襲、種植及遠處轉移等發病特點，血管生成在為腫瘤的發展提供氧氣和營養以及為腫瘤的擴散轉移提供通道中，都有著重要的作用[1]。所以EMT發展侵襲以有賴于血管的新生。VEGF[6,7]被認為是目前具有最強的促血管生長作用的一種血管生長因子，在新生血管的生成過程中起著關鍵性的調控作用。檢測血管生成因子VEGF及其可溶性受體sflt-1在子宮內膜異位癥中的表達，探究血管生成因子在EMT發生發展中的作用，能進一步推進EMT發病機制的生物分子學研究，為疾病的早期診治尋找無創的生物學檢測方法。

3.1 VEGF在EMT患者血清和異位內膜中的表達

VEGF是具有最高特異性的血管內皮細胞的有絲分裂劑，能誘導內皮細胞進行有絲分裂進行增生，促進局部新生毛細血管網結構的形成[8]。本實驗結果顯示VEGF在兩組，實驗組患者血清中的表達水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。同時，許曉月、崔軼凡[9,10]等研究表明，EMT患者血清中發現VEGF呈高表達。與本研究結論相符。在EMT患者血清中VEGF的表達存在異常，證明VEGF在EMT發病過程中可能存在促進的作用，同時也可為未來早期發現并診斷內異癥的提供新的檢測指標。卵巢激素能夠促進內膜細胞分泌VEGF，由于EMT的異位病灶與子宮在位的內膜組織具有同源性，所以異位內膜在卵巢激素影響下也能分泌VEGF，VEGF可使細胞外基質降解，使基質的屏障作用被破壞，使局部的微環境改變，從而促進異位病灶的進一步發生和發展[11]。李燦宇等[12]實驗結果顯示，VEGF在EMT的在位內膜及異位內膜中的表達水平均高于在正常內膜組織中的水平，且VEGF在在位內膜及異位內膜中的水平比較，差異無統計學意義。本課題結果顯示，兩組組織中VEGF mRNA的水平比較，實驗組明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），于上述研究結果相一致。VEGF mRNA在異位內膜中的高表達，能夠誘導內皮細胞的增殖分裂，促進新血管的形成，使異位內膜得以成功種植、發展，異位病灶進一步浸潤、蔓延，對盆腔周圍組織的破壞不斷擴大，使盆腔周圍組織的粘連等病理變化呈持續性發展。

3.2 sflt-1在EMT患者血清中和內膜組織中的表達

VEGFR-1在機體中可分解為sflt-1，sflt-1為VEGF的受體之一，兩者之間具有高度的親和力，VEGF與sflt-1結合后可誘導內皮細胞特異性有絲分裂，從而促進血管生成[13]。VEGF本身不具有生物學活性，需與VEGFR高度結合誘導內皮細胞的增殖分化，而促進血管生成[14]。本實驗檢測兩組血清中的sflt-1水平，結果顯示sflt-1在實驗組血清中的濃度明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。有研究認為VEGF可能促進sflt-1的進一步分泌，黃佼等[15]研究指出，sflt-1在EMT患者血清中的水平與血管內皮細胞的增殖能力呈正相關，EMT患者血清中sflt-1水平的檢測能有效的體現血管的生成能力。也證實了本研究的觀點。sflt-1和VEGF的高表達及結合，能誘導異位內膜中的腺體細胞的異常分化，影響著炎性因子在異位病灶內膜組織中的表達，促進了病灶在局部組織中的侵襲、浸潤及蔓延[16]。上述實驗結果已經提示，在異位內膜中VEGF mRNA呈現高水平，而關于sflt-1 mRNA在異位內膜中的表達，本研究結果顯示，sflt-1 mRNA在實驗組中的表達高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示sflt-1可能參與到EMT疾病的發生發展中，使得局部異位灶內膜組織具有更強的血管生長和增殖能力，存在異常的生物活性。

VEGF及sflt-1在EMT發病過程中的作用，可能包括：①sflt-1與血管的發芽即新血管生成的位置有關[17]，sflt-1與VEGF結合可誘導內皮細胞分化、增加微血管通透性，促進間質生成，促進血管的生長，為異位內膜組織細胞的生長提供血流供應，增加病灶的增殖活性；②sflt-1可以通過增加異位內膜腺體細胞的侵襲能力，使盆腔組織的被侵襲破壞、不斷浸潤周圍組織，使盆腔的粘連等病理變化呈持續性發展[18]；③子宮內膜隨經血逆流并在盆腔組織上種植后，異位病灶受卵巢激素周期性的影響而不斷生長，但異位病灶缺少在位子宮內膜的基底層結構，缺少血流的供應，使局部的組織處于相對缺氧的狀態。相關基因水平的研究表明，缺氧環境可直接提高VEGF的表達，促進新生血管的生成[19]；④同時，VEGF可破壞細胞外基質，影響基質的屏障作用，加重局部基底膜的破損，加快異位病灶生長、浸潤及蔓延，而異位病灶的生長又增加了VEGF的分泌表達，使病灶不斷地擴大、發展、侵襲，使疾病呈持續性加重[20]。

綜上所述，血管生長在EMT的發病過程中起著不可替代的重要作用，VEGF和sflt-1組成了高度親和力的血管生成信號通路，在血管生成的整個過程中都參與了調控的作用，VEGF及sflt-1在EMT患者的血清及異位內膜中都出現高表達，提示對疾病的發生發展發揮著促進的作用，可為EMT的早期診斷的無創性敏感性檢測方法提供新方法，同時也提供了EMT的抗血管治療的新思路。