探討環狀RNA標記物診斷脊柱結核的潛在價值

黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫院骨科，廣東深圳 518115

脊柱結核是肺外結核類型中最常見的一類，占骨結核總數的1/2左右[1]。臨床診斷脊柱結核需綜合分析患者的臨床表現、相關實驗室檢查結果及影像學特征，但脊柱結核早期影像及臨床表現缺乏特異性，實驗室檢查也不存在較典型的生化指標[2]。因此，早期明確診斷脊柱結核的難度較大，常因此出現漏診、誤診情況而貽誤治療時機[3-5]。近年來微小RNA（miRNA）經基因組學研究證實，可作為特異的生物標記物用于脊柱結核及相關疾病的鑒別診斷，但關于circRNA的臨床研究十分罕見[6-8]。本研究選取2016年6月—2018年9月深圳市第三人民醫院收治的50例脊柱結核患者為研究對象，擬針對脊柱結核患者差異性表達circRNA予以篩查鑒定，旨在探討其作為早期診斷脊柱結核分子標記物的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的50例脊柱結核患者作為研究組。納入標準：生長發育正常；年齡≥18歲；經臨床表現、實驗室檢查及影像學檢查確診；均接受手術治療；脊柱結核活動期同時具備嚴重骨質破壞、較大寒性膿腫；行徹底病灶清除術；組織病理學檢查結果發現干酪樣物質或朗罕斯細胞和（或）結核桿菌組織標本培養陽性；無其他可疑疾病；患者知曉本研究內容并簽訂知情同意書。排除標準：早期影像學表現不明顯患者；合并其他（脊柱外）臟器結核病患者；骨病治愈型、靜止型脊柱結核患者；行器官移植、同種異體組織移植及人工假體植入患者；合并人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等自身免疫性疾病患者。另選擇同期進行體檢的健康人員50名作為對照組，納入標準：生長發育正常；年齡≥18歲；不存在結核病史；T細胞斑點試驗及結核菌素（purified protein derivative,PPD）試驗檢測結果呈陰性；無其他可疑疾病。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集各抽取受試者2.5 mL空腹外周血，其中研究組外周血標本包括治療前及術后治愈兩種，血液凝固后于4℃條件下離心10 min（1 700 g）收集上層血清，再離心10 min（2 000 g）收集上清液，通過低速離心去除沉淀成分，血清置于-20℃冰箱中凍存待檢。

1.2.2 circRNA提取應用mirVana?PARIS?Kit提取血清循環circRNA，通過ND-1000分光光度計質檢所提取的循環circRNA，其完整性檢測使用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳。

1.2.3 circRNA篩選①使用Agilent公司生產的miRNAs Complete Labeling and Hyb試劑盒對血清circRNA予以標記反應及去磷酸化。②將對等體積Pre-Hybridization Mix注入后實施芯片預雜交，將Pre-Hybridization Mix吸除并注入雜交液，再將芯片放在雜交爐中進行旋轉雜交。完成雜交后移除雜交液，將Wash Buffer A加入后對芯片進行清洗染色，完成上述操作后實施芯片掃描。③聚類分析基因芯片數據。④通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術對circRNA表達進行檢測篩選，并對特異型循環circRNA進行驗證。根據表達上調或下調的circRNA表達水平，分析其與基因芯片篩選結果是否一致，實驗重復進行3次。在脊柱結核患者的血清中篩選出一組circRNA，建立circRNA表達譜模型。

1.3 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，計數資料采用頻數或率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

circRNA基因芯片初篩獲取存在表達差異circRNA36個，表達增高及降低的比例為15/21，見表1。經實時定量PCR驗證后發現，hsa-circRNA_400005表達量較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），與芯片檢測結果基本一致。聯合分析circRNA及miRNA表達譜發現，hsa-circRNA_400005與hsa-miR-19a-3p之間存在負相關關系（P＜0.05）。聚類分析結果見圖1。

表1 差異表達circ RNA差異倍數及P值Table 1 Differential folds and P values of differentially expressed circRNAs

3 討論

circRNA通常是由大于1個的外顯子所構成的一類環形RNA分子，被眾多研究人員認為是非隨機的、穩定的、豐富的、保守的RNA剪切產物[4]。circRNA可通過對miRNA表達的調控，實現對親本基因細胞增殖、轉錄、RNA結合蛋白所參與的基因表達進行調節的目的，這些均顯示出circRNA有診斷功能的良好潛力[9-12]。

本研究結果顯示，circRNA基因芯片初篩獲取存在表達差異circRNA36個，表達增高及降低的比例為15/21。經實時定量PCR驗證后發現，hsa-circRNA_400005表達量較對照組明顯升高（P＜0.05），與芯片檢測結果基本一致。聯合分析circRNA及miRNA表達譜發現，hsacircRNA_400005與hsa-miR-19a-3p之間存在負相關關系（P＜0.05），說明circRNA的確會參與脊柱結核病理發展進程。有研究指出，circRNA難以被miRNA、RNA酶降解，能夠更穩定地對miRNA功能表達加以調控[13-14]。單個circRNA分子中蘊含大量的MRE，可瞬間釋放或結合大量的miRNA，最終將調控作用高效發揮。聞芳等[15]認為，作為miRNA上游分子的circRNA同時靶向miRNA，進而對miRNA基因沉默作用加以抑制，很可能會在自噬作用中發揮重要作用，有力地證實circRNA參與脊柱結核的發生、發展過程。

綜上所述，脊柱結核患者存在大量特異循環表達的circRNA及miRNA，但circRNA的穩定性更高，可做為早期診斷脊柱結核更具潛力的分子標記物。