牡丹炭疽病菌拮抗內生細菌的分離鑒定及促生作用

石 楊， 呂長平， 帥佳琪， 毛 咪， 江莉娜

(1.湖南農業大學風景園林與藝術設計學院，湖南長沙 410128； 2.湖南農業大學園藝學院，湖南長沙 410128；3.湖南省中亞熱帶優質花木繁育與利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128)

牡丹為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬()多年生落葉灌木，具有極高的藥用、觀賞、油用價值。但在長期的人工栽培中，牡丹病蟲害的發生日益嚴重，影響了牡丹的利用價值。牡丹炭疽病為牡丹的主要病害之一。在濕熱的夏季，牡丹葉片病害尤為突出。

目前主要使用化學藥劑防治牡丹炭疽病，但在使用過程中不僅會造成環境污染，而且極容易使病原菌產生抗藥性。由于微生物農藥具有高效、低毒、環保及來源廣等優點，使其受到研究者的廣泛關注。目前用于防治的微生物主要有拮抗放線菌、拮抗真菌和拮抗細菌。植物內生菌是指在植物生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官的細胞間隙或細胞內的微生物類群。相比較于其他生防菌，植物內生菌所處的環境相對穩定，不易受外界溫度、紫外輻射等因素的影響，能夠在植物體內長期定殖，其獨特的優勢使其越來越多地應用于生防菌的研發。丁東玲等從藥用牡丹內部分離得到的短小芽孢桿菌()具有拮抗金黃色葡萄球菌的作用。

本研究擬從湖南農業大學花卉基地內健康牡丹的莖和根中分離、篩選、鑒定牡丹炭疽病菌拮抗菌株，并評估其拮抗能力，同時探究其對植物的促生特性。以期為進一步研究病原菌與內生菌的互作奠定基礎，為牡丹炭疽病防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 2019年12月，于湖南農業大學花卉基地內采集生長健壯的鳳丹、紫繡球、湘西粉3個牡丹品種的莖和根，帶回實驗室進行內生菌的分離。膠孢炭疽菌自行從發病的牡丹葉片中分離獲得。

1.1.2 試驗試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、營養(NA)培養基、R2A培養基、-1，3-葡聚糖培養基、羧甲基纖維素鈉(CMC)培養基、酪蛋白培養基。

PKO培養基：10 g葡萄糖、5.0 g Ca(PO)、0.5 g (NH)SO、0.2 g NaCl、0.2 g KCl、0.03 g FeSO、0.03 g MgSO·7HO、0.03 g MnSO、20 g酵母膏、20 g瓊脂、1 L蒸餾水，pH 值為6.8～7.0。

阿須貝氏培養基：0.2 g KHPO、0.2 g MgSO、0.2 g NaCl、5 g CaCO、10 g甘露醇、0.1 g CaSO、18 g 瓊脂、1 L蒸餾水。

金氏(King)培養基：20 g蛋白胨、1.5 g MgSO、1.15 g KHPO、15 mL CHO、0.1 g-色氨酸、1 L 蒸餾水。

比色液：1.5 mL 0.5 mol/L FeCl、30 mL HSO、50 mL蒸餾水。

以上試劑均來自北京酷來博科技有限公司，細菌提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP302-02]。

1.2 試驗設計

1.2.1 內生菌的分離 內生菌的分離、純化參照了Zhao等的方法進行，將平板上長出的單菌落保存于試管斜面中備用。

1.2.2 內生菌對牡丹炭疽病菌的拮抗篩選 采用五點對峙法測試內生細菌對炭疽病的拮抗作用。將內生細菌轉接于NA和R2A液體培養基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養72 h，制備拮抗菌菌懸液，備用。在炭疽菌菌落邊緣用打孔器取帶有菌絲的菌餅，并將其接入空白PDA平板正中央，同時以病原菌為中心，距離菌餅2.5 cm處，3個點上分別接入20 μL內生細菌菌懸液。將只接入病原菌菌餅作為空白對照，重復3次，28 ℃培養7 d左右，待對照組的菌絲長滿平板時，用十字交叉法測量菌落直徑。

內生菌拮抗病原菌抑菌率按如下公式進行計算：

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 拮抗菌發酵液抑菌試驗 將篩選出的最具拮抗作用的拮抗菌接種于液體培養基中，28 ℃、120 r/min 搖床培養3 d。將菌懸液分裝于離心管中，12 000離心10 min，上清液通過0.22 μm無菌過濾器。將拮抗菌株的無菌發酵上清液按4 ∶1的比例倒入 65 ℃ 固體培養基中并倒平板，將不加無菌發酵上清液作為對照；在平板中央接種牡丹膠孢炭疽菌菌餅(直徑6 mm)，設置3個重復。28 ℃恒溫培養，待對照病原菌長滿培養皿時，用十字交叉法測量菌落直徑，并計算無菌發酵上清液對病原菌生長的抑制率。

采用離體牡丹葉片接種：從花卉基地的健康牡丹植株上選取長勢一致的牡丹葉片。清水沖洗 1 min，用高溫消毒后的棉球蘸取75%的乙醇正反擦拭牡丹葉片，再用棉球蘸取無菌水進行擦拭，用無菌發酵液浸泡牡丹葉片30 min，并用無菌水作對照，用針刺葉片造成傷口，并在傷口上接種牡丹炭疽病菌菌餅，菌絲面貼近傷口，每張葉片接種1個菌餅，將處理的葉片放于準備好的保鮮盒中，每盒2張葉片，加無菌水至濾紙完全浸潤，蓋上盒蓋，每個處理10張葉片，28 ℃下保濕培養，每天觀察接種傷口情況，并根據濾紙的保水情況增加無菌水以保證盒內濕度。待病斑不再擴大后，觀察記錄。牡丹葉片面積病變比例=(-)×100，其中：為對照組牡丹葉片病變面積；為發酵上清液處理組牡丹葉片病變面積。

1.2.4 優良拮抗菌的鑒定 形態學鑒定：將純化后的優良內生拮抗細菌接于NA和R2A培養基，37 ℃培養3 d，觀察描述菌落形態，18～24 h菌齡時進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察。

分子生物學鑒定：細菌DNA按照細菌DNA快速提取試劑盒提供的方法進行提取。PCR擴增引物選用細菌16S rDNA通用引物(27F：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′；1492R：5′-G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)。PCR產物檢測委托北京擎科生物科技有限公司進行，將所得到的16S rDNA序列經過校對與BLAST中的GenBank序列采用 MEGA4.0軟件以鄰接法構建菌株系統發育樹。

1.2.5 促生能力測定 IAA(吲哚乙酸)分泌能力的測定參照Patten等的方法；溶磷能力測定參照許進嬌等的方法；固氮能力測定參照崔月貞等的方法。

1.2.6 拮抗細菌代謝分泌物測定-1，3-葡聚糖酶活性測定：將篩選的優良拮抗菌接種于-1，3-葡聚糖培養基中，每株拮抗菌3次重復，28 ℃培養 3 d。測定透明圈直徑與菌落的直徑，并計算其比值(值)。纖維素酶活性測定參照張平等的方法。蛋白酶活性測定：將拮抗菌接種于酪蛋白培養基中，每株拮抗菌重復3次，28 ℃條件下培養 3 d。然后測定透明圈與菌落直徑，并計算其比值(值)。

1.2.7 數據分析 試驗數據采用Excle及SPASS 3.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 牡丹炭疽病菌拮抗菌的篩選

將分離出的細菌與牡丹炭疽病菌進行對峙培養，共篩選出拮抗細菌9株(表1)。其中菌株 FJ1.3、ZJ1.5、XG1.4、ZJ1.4的抑菌效果最好，生長抑制率分別為51.39%、48.15%、41.67%、36.11%。因此選用FJ1.3、ZJ1.5、XG1.4、ZJ1.4菌株為牡丹炭疽病菌拮抗優勢內生菌株。

表1 不同內生菌菌株對病原菌的抑制效果

2.2 拮抗內生菌對病原菌的抑制

本試驗通過菌絲抑制法，測定最具拮抗作用的4株拮抗菌無菌發酵液對病原菌的抑制作用。結果表明(表2)，菌株FJ1.3的無菌發酵液對病原菌最具抑制作用，抑制率為35.13%，其次是菌株ZJ1.4，抑制率為34.54%。

表2 拮抗菌發酵液對病原菌的抑制效果

優良拮抗菌株對牡丹炭疽病菌的離體防效試驗(表3)結果表明，菌株FJ1.3病斑顯著小于清水對照。接種5 d后，菌株FJ1.3對牡丹炭疽病的防效達到47.06%。其次為菌株ZJ1.4，防效為22.48%。

表3 拮抗菌對牡丹炭疽病的防治效果

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態學鑒定 4株優良拮抗菌在37 ℃培養3 d后，4株菌株菌落形狀不規則，菌落不透明，菌株FJ1.3、ZJ1.5表面濕潤無光澤，菌株ZJ1.4、XG1.4表面濕潤有光澤，扁平，菌株ZJ1.5顏色為淺黃色，其余菌株均為白色(表4)。革蘭氏染色后，經顯微鏡觀察發現，4株菌株都為革蘭氏陽性菌。4株拮抗菌都符合芽孢桿菌屬()特征。

表4 株優良拮抗菌的形態特征

2.3.2 分子生物學鑒定 將4株優良炭疽病菌拮抗菌進行測序后，登錄NCBI數據庫，通過BLAST對測序結果進行比對分析，并構建系統發育樹。結合系統發育分析結果(圖1)，菌株FJ1.3最相似菌株為枯草芽孢桿菌()，相似性為99.50%。菌株ZJ1.5最相似菌株為解淀粉芽孢桿菌()，其相似性為99.50%。菌株ZJ1.4最相似菌株為特基拉芽孢桿菌()，相似性為99.60%。菌株XG1.4最相似菌株為嗜堿芽孢桿菌()，相似性為96.33%。

2.4 拮抗菌促生潛能的測定

所篩選出的4株菌株在與比色液結合后呈現出不同深度的紅色，表明4株菌株均具備分泌IAA的能力，顏色越深，分泌IAA能力越強。菌株ZJ1.5分泌IAA能力最強，IAA濃度高達17.02 mg/L，菌株FJ1.3分泌IAA能力次之，為16.94 mg/L(表5)。篩選出的4株拮抗細菌在無氮培養基中能正常生長，故都具有固氮能力(圖2)。4株拮抗細菌在PKO培養基上生長無明顯溶磷圈，表明其不具備溶磷能力(圖3)。

表5 拮抗細菌分泌IAA能力測定

2.5 拮抗細菌代謝分泌物的測定

拮抗細菌ZJ1.5、FJ1.3、ZJ1.4、XG1.4生長過程中都具有產蛋白酶的能力(圖4)，酶產量最高的為菌株ZJ1.5，其透明圈直徑與菌落直徑的比值達到5.67(表6)。在CMC培養基上，3株菌株ZJ1.5、ZJ1.4、FJ1.3均能生長出菌落，并使菌落周圍的剛果紅顏色消失而形成透明圈(圖5)，其中酶產量最高的為菌株FJ1.3，其透明圈直徑與菌落直徑的比值達到22.50(表7)。在-1，3-葡聚糖培養基上，4株菌株均不能使培養基中的藍色消失，表明4株菌株均不能產生-1，3-葡聚糖酶(圖6)。

表6 拮抗菌株產蛋白酶的測定結果

表7 拮抗菌株產纖維素酶的測定結果

3 結論與討論

3.1 內生細菌的促生作用

由于植株內部環境條件不易受改變，容易定殖，不易受到外界環境因素的影響，漫長的進化選擇使植株體內的組分相對固定。Gaiero等研究發現，植株內生和根際微生物可以通過溶磷、固氮、分泌IAA等方式直接影響植物的新陳代謝，從而對植株的生長發育產生影響。目前研究者從多種植物體內都分離出對植株具有促生作用的內生細菌，如黃瓜內生菌枯草芽孢桿菌可通過固氮和產鐵載體的作用來促進黃瓜種子萌發和幼苗的生長；野大豆內生細菌普羅威登斯菌屬()具有溶磷能力，溶磷量為46 mg/L，且具有產IAA能力，達到19.97 mg/L，1-氨基環丙烷-1-羧基(ACC)脫氨酶活性達到8.59 μmol/(mg·h)，菌株處理小麥10 d后，促生效果最顯著，株高、根長、葉干質量與根干質量分別增加58.46%、81.89%、54.87%、29.9%。

本試驗篩選的優良菌株都可產生IAA和固氮能力，但都不具有溶磷能力。在本試驗的研究中發現菌株分泌IAA的量存在差異。本試驗菌株ZJ1.5最相似菌株為解淀粉芽孢桿菌，產生IAA量最高，達17.02 mg/L，其次為菌株FJ1.3，其最相似菌株為枯草芽孢桿菌，產IAA量為16.94 mg/L，但兩者之間產IAA量差異不顯著。從野大豆中分離出的內生細菌假單胞菌(sp.)產IAA為19.97 μg/mL，對水稻幼苗具有明顯的促進作用。這些研究與本試驗結果基本一致，表明宿主植物內定殖了大量產生IAA的內生菌資源。劉麗輝等從南方野水稻中分離出的內生細菌織片草螺菌()產IAA能力高達29.97 mg/L，固氮酶活性高達494.14 nmol/mL，有力地支持了本研究結果。

3.2 內生細菌的拮抗作用

植物與微生物關系緊密，通過構建根際微生物區系，植物根部分泌的代謝物可驅使植物生長和發生防御反應，而細菌基因組特性決定了其對宿主的適應性。近年來，利用植物內生菌來抑制植物病原微生物進行生物防治的研究在國內外已展開，這些研究為牡丹炭疽病的生物防治提供了新的思路和借鑒。本研究從牡丹的根和莖中分離出了64株內生細菌，經過篩選測試，牡丹內生菌菌株FJ1.3、ZJ1.4、ZJ1.5、XG1.4對牡丹炭疽病菌具有較強的拮抗作用。抑菌率在36%以上，其中 FJ1.3 的抑菌率達到51.39%。無菌發酵液試驗中抑菌率最高的菌株為FJ1.3，達到35.13%，其次是菌株ZJ1.4，抑菌率為34.54%。在離體葉片防效試驗中防治效果最佳的菌株為FJ1.3，防效為47.06%。牡丹內生菌接種處理牡丹炭疽病菌，出現抑制炭疽病菌菌絲生長的現象，可能原因是內生菌與病原菌對峙過程中產生了化感物質及胞外代謝產物，如解毒酶、水解酶類等。陳思宇等的研究支持這個解釋，水稻紋枯病菌拮抗細菌通過產生蛋白酶和嗜鐵素對水稻紋枯病菌產生抑制作用。本試驗初步探究了拮抗牡丹炭疽病菌的內生細菌的代謝分泌物。4株優良拮抗細菌都具有分泌蛋白酶和纖維素酶的能力，而不具有分泌-1，3-葡聚糖酶的能力。Kamensky等研究支持了這一結論，發現蛋白酶能夠對菌核病和灰霉病產生抑制作用。Singh等研究發現，類芽孢桿菌產生-1，3-葡聚糖酶，可破壞枯萎病病原菌的細胞壁，導致菌絲自溶、斷裂。本研究僅對內生菌代謝分泌物進行初步探索，對內生菌代謝酶活性還需進一步探索。