氧化銅/蛋白質復合物的過氧化物酶及抗菌活性

石 成，呂 中

武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205

細菌引起的感染已成為威脅人類健康的常見病、多發病，抗生素是治療細菌感染的主要藥物［1］。隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用導致細菌產生了嚴重的耐藥性問題［2-3］，而新批準上市的抗生素越來越少［4］，因此開發新型抗菌劑迫在眉睫。

近年來一類具有類似天然酶活性的納米材料——納米酶廣受關注。納米酶具有類似天然酶的高效催化活性，同時還具有穩定性強、易于生產且成本低的優點，在生化檢測、疾病診斷等領域顯示出了巨大應用前景［5］。近年來研究發現具有過氧化物酶活性的納米酶具有抗菌活性，且細菌不易產生耐藥性［6-7］。這些納米酶通過催化過氧化氫（H2O2）產生毒性更高的羥基自由基（?OH）等活性氧物質，對細菌產生殺傷作用。目前已報道的具有抗菌活性的納米酶主要有金屬單質及金屬氧化物等，例如，Wu 等［8］合成具有過氧化物酶性能的鉑中空納米枝晶，對小鼠的傷口感染具有較好療效；Wang 等［9］合成鈷釩混合金屬氧化物納米酶，對大腸桿菌具有高效的殺傷效果。

氧化銅（CuO）是一種性能優良的P 型多功能窄禁帶半導體，其制造成本低且化學性質穩定，已廣泛應用于氣體傳感器、催化、電池以及高溫超導體等領域［10］。目前已報道CuO 具有過氧化物酶活性［11］，可用于廢水處理［12］和分子檢測［13］等領域，但利用其過氧化物酶活性進行抗菌的研究卻鮮有報道。

本研究以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為模板合成納米CuO，使材料具有良好的生物相容性和穩定性［14-15］。進一步研究所合成材料的過氧化物酶活性及抗菌活性，為開發生物相容性好的納米酶抗菌劑提供實例。

1 實驗部分

1.1 實驗原料與儀器

BSA（阿拉丁試劑有限公司）；三水合硝酸銅［Cu（NO3）2·3H2O］（國藥集團化學有限公司）；3，3'，5，5'-四 甲 基 聯 苯 胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）（Sigma-Aldrich 有限公司）；對苯二甲酸（terephthalic acid，TA）（Adamas 有限公司）；其他試劑均采用分析純。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，ATCC9118）（中國典型培養物保藏中心）；Mueller-Hinton（MH）生物培養基（AOBOX 有限責任公司）。

X-射線 衍 射 儀（X-ray diffractometer，XRD）（型號SmartLab SE，日本理學株式會社）、場發射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）（型號SU8010，日立高新技術公司）、激光粒度儀（laser particle size analyzer，DLS）（型號Zetasizer Nano ZS，英國馬爾文儀器有限公司）、紫外可見分光光度計（ultra-violet and visible spectrophotometer，UV-vis）［型號UV-1900，島津儀器（蘇州）有限公司］、熒光分光光度計（型號F-4700，日立高新技術公司）、同步熱分析儀（synchronous thermal analyzer， TGA）（ 型 號STA449F5 Jupiter，德國耐馳儀器制造有限公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）（型號TENSON II，德國布魯克公司）。

1.2 CuO-BSA 納米復合物的制備與表征

將60 mg Cu（NO3）2·3H2O 和125 mg BSA 分別溶解在25 mL 水中，混合后在室溫下攪拌30 min，緩慢滴加1 mL 氫氧化鈉（1 mol/L）溶液，將混合物置于85 ℃水浴反應2 h。將反應后的溶液于10 000 r/min 下離心15 min 收集沉淀，分別用純水和無水乙醇各洗滌3 次，冷凍干燥后得到CuO-BSA。另外，在不加BSA 且其他條件不變的情況下合成CuO。

采用XRD 對合成的材料組成進行分析，掃描角度為20°~90°；采用TGA 和FTIR 分析材料的組分；采用DLS 分析材料的粒徑；采用FE-SEM 觀察CuO-BSA 納米復合物的形貌及大小。

1.3 CuO-BSA 納米復合物的過氧化物酶活性及穩態動力學測定

CuO-BSA 的過氧化物酶活性測定：在醋酸緩沖液（pH 4.0，0.2 mol/L）中依次加100 μL 2 mg/mL的CuO-BSA 復合物、50 μL 100 mmol/L 的H2O2溶液和50 μL 24 mmol/L 的TMB 溶液構成2 mL 體系，于35 ℃反應20 min，12 000 r/min 條件下離心2 min，取上清液進行UV-vis 掃描。以CuO-BSA+TMB 組、H2O2+TMB 組 以 及 單 獨TMB 組 作 為 對照。實驗重復3 次。

穩態動力學研究采用固定一種底物濃度，測定反應速率隨另一種底物濃度變化的曲線。

CuO-BSA 催化TMB 動力學測定：向1 800 μL醋酸鹽緩沖液中分別加入50 μL濃度為400 mmol/L的H2O2溶液、50 μL 濃度分別為0.4~24 mmol/L 的TMB 溶液和100 μL 質量濃度為2 mg/mL 的CuOBSA復合物，混勻后進行UV-vis掃描。實驗重復3次。

CuO-BSA 催化H2O2動力學測定：向1 800 μL醋酸鹽緩沖液中分別加入50 μL 濃度為24 mmol/L的TMB溶液、50 μL濃度分別為0.4~4 mol/L的H2O2溶液和100 μL 質量濃度 為2 mg/mL 的CuO-BSA復合物，混勻后進行UV-vis 掃描。實驗重復3 次。

所有反應均是測定反應開始300 s 內氧化態TMB（oxidation state TMB，oxTMB）在652 nm 處的吸光度隨時間變化的曲線，然后由公式（1）計算得到相對應濃度底物的初始反應速率V，如下：

其中，ΔC為Δt時間段內oxTMB 的濃度變化值，ΔA為Δt時間段內oxTMB 在652 nm 處的吸光度變化 值，ε為oxTMB 在652 nm 處的摩爾吸光 系 數［39 000（mol/L）-1·cm-1］［16］，L為光程長（1.0 cm）。

然后，對初始反應速率V和初始體系中的底物濃度［S］用米氏方程［Michaelis-Menten 擬合（公式2）］［16］，如下：

其中，V為初始反應速率，［S］為底物濃度，Vmax為最大反應速率，Km為米氏常數。Km值反應納米酶對底物的親和力，值越小，說明酶對底物的親和力越高，反之則越低。

1.4 羥基自由基測定

在醋酸緩沖液中加入100 μL 2 mg/mL 的CuO-BSA 復合物、100 μL 20 mmol/L 的H2O2溶液和100 μL 10 mmol/L 的TA 溶液構成2 mL 體系，反應2 h，測定315 nm 激發下的熒光光譜。以CuOBSA+TA 組、H2O2+TA 組 和 單 獨TA 組 作 為 對 照。實驗重復3 次。

1.5 CuO-BSA 復合物催化H2O2抗菌活性測定

將100 μL 1×106CFU/mL 菌 液 與 終 濃 度 為1 mmol/L H2O2和100 μg/mL CuO-BSA 混合，反應體系為2 mL，37 ℃培養1 h，取菌液涂布平板，37 ℃恒溫培養24 h 后進行菌落計數。以細菌+H2O2、細菌+CuO-BSA 和細菌三組作為對照組。實驗重復3 次，每次取3 個平行。

2 結果與討論

2.1 材料表征

圖1（a）為所合成的CuO-BSA 和CuO 的XRD圖譜。從圖中可知，CuO-BSA 和CuO 兩者衍射峰與單斜CuO 的標準卡片譜（JCPDS 48-1548）對應，表明這2 種材料均為CuO。圖1（b）為CuO-BSA、CuO 和BSA 的TGA 圖譜。可知，當溫度達到600 ℃時，CuO-BSA 剩余的質量分數約為74%，CuO 剩余的質量分數約為95%，BSA 剩余的質量分數約為22%，這說明CuO-BSA 上負載有BSA。從FTIR 圖中可以看出，CuO-BSA 在1 653 cm-1和1 559 cm-1處、BSA 在1 653 cm-1和1 540 cm-1處均各有2 個肽鍵特征峰，而CuO 處無相應的特征峰，這進一步說明CuO-BSA 上存在著BSA［圖1（c）］。合成的CuO-BSA 平均粒徑為201.2 nm［圖1（d）］。圖1（e）和圖1（f）為CuO-BSA 的FE-SEM 圖。從圖中可知，CuO-BSA 為梭狀，表面粗糙，顆粒大小分布較為均勻，顆粒的尺寸與DLS 結果基本一致。

圖1 CuO-BSA 納米復合物的表征：（a）XRD 圖譜，（b）TGA 曲線，（c）FTIR 圖譜，（d）DLS 圖，（e，f）FE-SEM 圖Fig.1 Characterization of CuO-BSA nanocomposites：（a）XRD patterns，（b）TGA curves，（c）FTIR spectra，（d）DLS diagram and（e，f）FE-SEM images

2.2 CuO-BSA 復合物的過氧化物酶活性

過氧化物酶催化H2O2還原，同時無色底物TMB 氧化為藍色的oxTMB，其在652 nm 處有最大吸收峰［8］，反應式（3）如下：

基于此，CuO-BSA 復合物的過氧化物酶活性結果如圖2（a）所示。單獨TMB 體系和TMB+CuO-BSA 體系在652 nm 未出現特征吸收峰，說明TMB 沒有發生氧化反應。無CuO-BSA 時，TMB+H2O2體系在652 nm 處有1 個弱的吸收峰，說明TMB 能被H2O2弱氧化。CuO-BSA 存在時652 nm處吸收值顯著增加，表明反應體系中產生了更多氧化產物oxTMB。綜上結果表明，CuO-BSA 復合物能催化H2O2氧化TMB，具有類似天然過氧化物酶的活性。

進一步考察材料濃度、pH 和溫度對CuO-BSA類酶活性的影響。由圖2（b）可知，隨著CuO-BSA濃度增加，反應速率增加，表明CuO-BSA 的催化活性存在濃度依賴關系。CuO-BSA 復合物的類酶活性受pH 和溫度的影響，酶催化反應存在最適pH 和最適溫度，pH 為4 和溫度為55 ℃時反應速率達到最大。隨著pH 和溫度的增加，反應速率反而下降，當pH 為6 時，CuO-BSA 復合物僅保留26.0%的相對活性，而當反應溫度達到75 ℃時，該復合物的相對活性僅存22.4%［圖2（c）和圖2（d）］。天然辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的最適溫度為40 ℃，并且55 ℃時活性僅剩約50%［17］。CuO-BSA 復合物與天然HRP 相比，最適溫度提高約15 ℃，表現出更高的熱穩定性以及能承受更高的反應溫度。

圖2 CuO-BSA 過氧化物酶活性及反應條件對酶活性的影響：（a）CuO-BSA過氧化物酶活性，（b）不同濃度的CuO-BSA過氧化物酶活性，（c）pH,（d）溫度Fig.2 CuO-BSA peroxidase activity and effect of reaction conditions on enzyme activity：（a）CuO-BSA peroxidase activity，（b）CuO-BSA peroxidase activity at different concentrations，（c）pH，（d）temperature

2.3 CuO-BSA 復合物的過氧化物酶穩態動力學

CuO-BSA 復合物催化H2O2氧化TMB 的反應速率與底物濃度的關系見圖3，通過Origin 2018 軟件計算得出CuO-BSA 復合物對底物TMB 和H2O2的動力學參數Vmax值和Km值，列于表1 中，并與天然HRP 以及已報道的Fe3O4納米酶的動力學參數進行比較。復合物CuO-BSA 對底物TMB 的Km值為0.29 mmol/L，低 于HRP，高 于Fe3O4，說 明CuO-BSA 對底物TMB 的親和力高于HRP，卻比Fe3O4納米酶低。另一方面，CuO-BSA 對底物H2O2的Km值 低 于Fe3O4，高 于HRP，說 明CuO-BSA 對底物H2O2的親和力高于Fe3O4，卻又低于HRP。CuO-BSA 對底物TMB 和H2O2的Vmax值比HRP、Fe3O4對兩種底物的Vmax值低。以上結果表明，用生物大分子BSA 作為模板和分散劑合成的納米CuO，對底物TMB 表現出的親和力較天然HRP 更高。

表1 CuO-BSA 與HRP 及Fe3O4納米酶的動力學參數比較Tab.1 Comparison of kinetic parameters of CuO-BSA with HRP and Fe3O4 nanozymes

圖3 CuO-BSA 復合物的穩態動力學曲線：（a）反應速率隨TMB濃度變化的曲線，（b）反應速率隨H2O2濃度變化的曲線Fig.3 Steady-state kinetic curves of CuO-BSA complex：（a）curve of reaction rates at different TMB concentrations，（b）curve of reaction rates at different H2O2 concentrations

2.4 羥基自由基測定

文獻［19］表明，Au/CuS 納米復合物的過氧化物酶活性來源于納米粒子表面Cu2+的芬頓反應，其反應如下：

在反應過程中，Cu2+催化H2O2生成大量具有強氧化性的?OH，該?OH 能氧化底物生成有色底物。因此，推測CuO-BSA 納米復合物的過氧化物酶活性也可能來源于該納米粒子表面的Cu2+的芬頓反應，反應如上，該過程中產生了強氧化性的?OH，使得底物TMB 氧化生成藍色產物oxTMB。

為了探究CuO-BSA 催化反應機理，用TA 作為熒光探針來檢測?OH 的產生。TA 本身沒有熒光，其捕獲?OH 并與其反應形成有熒光的2-羥基對苯二甲酸（2-hydroxyterephthalic acid，TA-OH）復合物［20］。如圖4所示，單獨的H2O2產生少量?OH，CuO-BSA 存在時催化H2O2產生?OH 的量顯著增加。以上實驗結果表明CuO-BSA 催化H2O2氧化TMB 反應的過程中產生了具有強氧化性的?OH。

圖4 TA 捕獲?OH 的熒光光譜圖，插圖為對應曲線的放大圖Fig.4 Fluorescence spectra of TA capturing?OH，inset showing enlarged view of corresponding curve

2.5 CuO-BSA 復合物催化H2O2抗菌活性

CuO-BSA 能催化H2O2產生?OH，而?OH 抗菌活 性 高 于H2O2［21］，基于 此，評 估 了CuO-BSA 與H2O2聯用對S.aureus的抗菌性能。從圖5 可以看出，CuO-BSA+H2O2組的細菌存活率僅為3.1%，而單獨CuO-BSA 組、單獨H2O2組則分別存活了73.5%和35.3%的細菌，遠遠高于CuO-BSA+H2O2處理組。這一結果表明，CuO-BSA 復合物催化H2O2有顯著的殺菌效果，抗菌能力的提高與CuOBSA 催化H2O2產生?OH 有關。

圖5 CuO-BSA 與H2O2聯用對S.aureus 的抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of CuO-BSA combined with H2O2 against S.aureus

3 結 論

本文以BSA 為模板，采用水熱法合成了具有較好生物相容性的CuO-BSA 納米復合材料。利用H2O2/TMB 比色體系證明了CuO-BSA 復合物具有過氧化物酶活性，在pH 為4 以及溫度為55 ℃條件下表現出最佳的酶活性，相比天然HRP，最適反應溫度提高約15 ℃。動力學研究表明，CuO-BSA對底物TMB 的親和力高于HRP。CuO-BSA 催化H2O2產 生?OH，對S. aureus有較好的殺菌效果。本研究為采用納米酶作為抗菌劑提供了實例。