羧甲基茯苓多糖對香菇貯藏保鮮效果的影響

姚韶華，程雅清，武若楠，臧瑞祥，李新偉，雷于國，劉啟燕，胡國元*

1. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205；

2. 湖北裕國菇業(yè)股份有限公司，湖北隨州 441300；

3. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北武漢430070

羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachyman，CMP）的制備多采取從茯苓菌核中提取或從茯苓發(fā)酵液提取的茯苓多糖經(jīng)化學(xué)修飾的方法，本實(shí)驗(yàn)室建立了通過茯苓發(fā)酵直接制備CMP 的方法［1-2］。大量文獻(xiàn)報(bào)道CMP 具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的生態(tài)平衡和減輕結(jié)腸損傷的作用［2-4］。CMP 目前在食品保鮮領(lǐng)域上應(yīng)用還鮮有報(bào)道。

香菇是我國食用菌年產(chǎn)量最大的單品［5］。由于新鮮的香菇采后含有較高的水分，新陳代謝旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗快，易受到機(jī)械傷害，引起子實(shí)體的褐變或腐敗變質(zhì)，影響其藥用和食用價(jià)值，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。目前多糖類生物保鮮劑在香菇保鮮研究領(lǐng)域受到青睞。有研究發(fā)現(xiàn)多糖類保鮮劑涂膜處理香菇后，在貯藏期內(nèi)延緩了香菇營養(yǎng)品質(zhì)的下降，同時對香菇體內(nèi)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性起到抑制作用［7-8］。PPO 是果蔬酶促褐變的主要酶類，同樣也是導(dǎo)致香菇褐變的主要酶類，褐變對香菇的色澤及感官品質(zhì)都有很大的影響，因此在香菇保鮮范疇內(nèi)對它的研究是相當(dāng)重視［9］。

為提高貯藏期內(nèi)新鮮香菇的商品和食用價(jià)值，延長香菇貨架期，減少經(jīng)濟(jì)損失［10-11］。本研究通過探究CMP 對香菇體內(nèi)PPO 體外酶活的抑制作用，初步確定CMP 對香菇保鮮試驗(yàn)的有效性和保鮮試驗(yàn)所用CMP 濃度，通過不同濃度的CMP 處理香菇，研究其對香菇保鮮效果的影響，找到最佳的CMP 保鮮濃度，并對CMP 的應(yīng)用提供了一條新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 材料與試劑 茯苓菌株Z1 由湖北省中醫(yī)藥研究院王克勤研究員惠贈，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保藏。

香菇子實(shí)體（菌種號為0912）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

3，5-二硝基水楊酸（成都科龍化工試劑廠）；沒食子酸、福林酚、Na2CO3、無水乙醇（天津博迪化工股份有限公司）；葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、無 水乙醇、2，6-二氯靛酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、苯酚、考馬斯亮藍(lán)G-250（麥克林）。以上試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計(jì)：T6 新世紀(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；冰箱：LSC-288G（浙江星星冷鏈集成股份有限公司）；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D（Ⅲ）（河南省予華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9053A（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)：Multifuge X1R［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺：SW-CJ-2FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱：MQT-60R（上海旻泉儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9080（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香菇預(yù)處理 自湖北省農(nóng)科院采摘的香菇，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分揀，去除田間熱。選擇未開傘、大小均勻、色澤黃褐、無破損、無畸形、無病蟲危害的香菇。

1.2.2 CMP 的發(fā)酵及制備 參考文獻(xiàn)［1］方法：茯苓菌種活化→茯苓液體種子制備→CMP 發(fā)酵→過濾收集發(fā)酵液上清→濃縮→醇沉→離心→沉淀物烘干→CMP 粗品→Sevage 法除蛋白→取上清烘干→CMP 樣品，備用。

1.2.3 多酚氧化酶活性的測定 （1）香菇多酚氧化酶的提取。參考文獻(xiàn)［12］方法：取1.0 g 香菇樣品，加入pH 7.0 磷酸鹽緩沖液3.0 mL，在冰浴條件下研磨勻漿并轉(zhuǎn)移到離心管中，再用7.0 mL 磷酸鹽緩沖液沖洗研缽，合并提取液靜止40 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，上清液即為PPO 粗提液，收集并于4 ℃冰箱保存待用。

（2）CMP 溶液對香菇多酚氧化酶體外活性抑制作用的測定。分別向試管中加5 mL pH 值7.0的磷酸緩沖液（0.05 moL/L），分別加入1 mL 2、4 、6、8、10 mg/mL 的CMP 溶液，40 ℃溫 度 下水 浴10 min 后，加入預(yù)熱的酶液1 mL，平衡10 min，然后加入1 mL 預(yù)熱鄰苯二酚（0.3 mol/L），開始計(jì)時，每30 s 記錄1 次OD420 隨時間的變化值，以最初直線段的斜率計(jì)算酶活力。以未加酶液為對照組，以未加CMP 溶液組的酶活為起始酶活。一個酶活力單位定義為在測定條件下，每分鐘引起光密度值改變0.001 所需的酶量［9，13-14］，CMP 溶液處理前后酶活變化以酶活抑制率表示，并以CMP 質(zhì)量濃度為X軸，以孢子萌發(fā)抑制率為Y軸繪制擬合曲線并建立抑制率回歸方程。

1.2.4 保鮮試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將香菇隨機(jī)分成4 組，每組25 個樣品，分別用3 個不同質(zhì)量濃度的CMP 溶液噴灑香菇表面20 s，即5、10、20 mg/mL CMP 溶液處理組實(shí)驗(yàn)。不做任何處理對照組（control check，CK）。處理結(jié)束后，自然晾干表面水分，將4 組香菇分別裝入保鮮袋中放置于4 ℃冰箱中貯藏，每4 d 分別從每組取樣測定其感官品質(zhì)、可溶性蛋白、還原糖、總糖和抗壞血酸（vitamin C，VC）質(zhì)量濃度，各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測定3 次。

1.2.5 保鮮試驗(yàn)測定指標(biāo) （1）香菇感官品質(zhì)評分指標(biāo)測定。參考高帥平等［15］的感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)，并且固定5 人每4 d 對香菇的感觀品質(zhì)進(jìn)行評分，從色澤，硬度，氣味，開傘度分別評價(jià)，權(quán)重依次為30%，30%，30%，10%。

（2）可溶性蛋白含量測定。參考Huang 等［16］方法：采用考馬斯亮藍(lán)法測定，用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。準(zhǔn)確稱取1.0 g 香菇，加入10 mL 磷酸緩沖液（pH=7），冰浴中充分研磨，離心。吸取上清液1 mL 于試管中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置5 min 后測定595 nm 下的吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量。

（3）還原糖和總糖含量測定。樣品處理參考姜天甲［17］的方法，還原糖標(biāo)曲的制備參考國標(biāo)法NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測定3，5-二硝基水楊酸比色法》，總糖標(biāo)曲的制備參考國標(biāo)法SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》。取上清液，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品提取液中總糖和還原糖的含量。

（4）VC 含量測定。樣品處理參考姜天甲［17］的方法，采用2，6-二氯靛酚法［16］進(jìn)行測定。

（5）總酚含量測定。樣品處理及測定參考姜天甲［17］的方法。樣品處理：稱取5 g 樣品于研缽中，加入10 mL 預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇充分研磨后倒入錐形瓶中，搖床搖動20 min，充分提取，離心，吸取上清液1 mL，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作，760 nm 測定其吸光值，計(jì)算總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 計(jì)算出各指標(biāo)含量，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 2019 繪制作出柱形圖，采用GraphPad Prism 5 繪制折線圖同時進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液對香菇多酚氧化酶體外酶活的影響

用香菇多酚氧化酶體外酶活實(shí)驗(yàn)來檢測CMP溶液對香菇PPO 體外酶活的是否具有抑制效果，根據(jù)圖1（a）結(jié)果所示，CMP 對香菇PPO 體外酶活具有抑制作用。并擬合CMP 溶液對香菇PPO 體外酶活抑制率的回歸方程為Y=4.442 5X+ 30.398，R2=0.952 5。根據(jù)抑制率回歸方程計(jì)算得到CMP溶液對香菇PPO 體外酶活的IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

2.2 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對香菇感官品質(zhì)的影響

香菇采后自身代謝活動依舊活躍，受外界的影響對其外觀及氣味都有一定的影響，感官指標(biāo)是評價(jià)商品品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一，直接影響著商品價(jià)值［15］。貯藏期間香菇的感官指標(biāo)變化如圖1（b）所示，在貯藏期間處理組均高于對照組，CMP 溶液處理組香菇的感官評分與對照組感官評分相比具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明CMP溶液處理組對香菇感官評定具有一定的效果，其中10、20 mg/mL CMP 溶液處理組效果更好些（P＜0.05），有利于香菇貯藏期的延遲。

2.3 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對香菇可溶性蛋白含量的影響

香菇在采后貯藏期間，蛋白質(zhì)會在蛋白酶的作用下分解產(chǎn)生氨基酸和多肽，同時會釋放菇體生命活動所需的能量，隨著貯藏時間的延長進(jìn)一步衰老，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢低［18］。蛋白質(zhì)含量的高低影響著香菇的營養(yǎng)價(jià)值，也在一定程度上反映了機(jī)體的抗氧化水平。由圖2（a）可知，香菇可溶性蛋白質(zhì)含量隨著貯藏期的延長呈下降趨勢。處理組香菇蛋白質(zhì)貯藏前期（4~12 d）下降速率緩慢，對照組貯藏期在4 d 后開始急速下降，其主要原因可能是貯藏前期處理組香菇的蛋白質(zhì)分解代謝低于對照組。貯藏前期對照組可溶性蛋白含量高于處理組可能跟香菇自身的水分散失有關(guān)［19］。貯藏期達(dá)到第20 d 時，5、10、20 mg/mL CMP 溶液處理組分別是對照組的139.82%、145.01%、186.58%。結(jié)果表明20 mg/mL CMP 溶液與對照組相比能夠有效抑制可溶性蛋白質(zhì)的分解（P＜0.05），延緩可溶性蛋白質(zhì)含量的下降速率。

2.4 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液對香菇還原糖和總糖含量的影響

還原性糖是采后呼吸作用的主要底物，隨著貯藏時間的延長，機(jī)體呼吸作用不斷消耗糖類物質(zhì)，導(dǎo)致香菇的還原糖含量下降，這與腐爛程度也有一定關(guān)系［15］，同時也是香菇營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)。由圖2（b）可知，香菇還原糖含量隨著貯藏期的延長呈下降趨勢，處理組在貯藏中期（8~16 d）較對照組來說下降緩慢（P＜0.05），原因可能是香菇體內(nèi)大分子化合物的分解，促進(jìn)了小分子還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升［20］，CMP 5 mg/mL 處理組下降趨勢要小于其他處理組，貯藏期20 d 時，5，10，20 mg/mL CMP溶液處理組分別是對照組的220.39%，135.53%，128.25%。說明處理組的香菇與對照組相比能保持較高的還原糖含量，延緩香菇的品質(zhì)下降。

圖2 不同濃度CMP 溶液處理對香菇可溶性蛋白含量（a），還原糖含量（b），總糖含量（c），VC 含量（d），總酚含量（e）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of CMP solutions on soluble protein content（a），reducing sugar content（b），total sugar content（c），VC content（d）and total phenol content（E）of L.edodes

總糖在香菇采后貯藏中是其代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，含量的下降是組織衰老的重要指標(biāo)。貯藏期間總糖含量變化，由圖2（c）可知，處理組香菇總糖含量變化呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，對照組香菇總糖含量變化呈現(xiàn)下降趨勢。處理組總糖含量后期均呈上升趨勢，可能是由于噴施的外源多糖對香菇內(nèi)源糖源產(chǎn)生的影響。貯藏期達(dá)到第20 d 時，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總糖含量變化分別是對照組的157.36%，146.22%，166.37% 。結(jié)果表明，CMP 溶液處理香菇有利于保持較高的香菇總糖含量，提高了香菇的營養(yǎng)品質(zhì)，其中20 mg/mL CMP 溶液效果最好（P＜0.05）。

2.5 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對香菇VC 含量的影響

貯藏前期VC 含量下降可能與子實(shí)體后熟衰老和品質(zhì)劣變有關(guān)［21］，香菇貯藏期間VC 含量變化，由圖2（d）可知，處理組香菇VC 含量變化先下降后上升再維持在一定水平，與姜天甲［17］的研究結(jié)果一致，對照組VC 含量變化先下降后上升再下降。貯藏前4 d，對照組VC 含量急劇下降，處理組下降緩慢（P＜0.05），前4 d VC 含量急劇下降是由于香菇的呼吸作用及氧化作用的進(jìn)行［17］，由于香菇后熟過程中伴隨著維生素C 的合成代謝，在貯藏初期呈現(xiàn)上升的趨勢［22］，隨后香菇子實(shí)體的維生素C 由于分解代謝，以及抗氧化反應(yīng)，含量下降［23］。貯藏后期（12 d 后）處理組維持在較高水平，延緩VC 的消耗，貯藏20 d 時，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組分別是對照組的132%，170%，180%。結(jié)果表明：處理組具有延緩香菇中VC 含量效果。

2.6 不同質(zhì)量濃度CMP 溶液處理對香菇總酚含量的影響

酚類物質(zhì)許多是木質(zhì)素合成的前體，食用菌中的酚類物質(zhì)與其抗氧化活性有一定的關(guān)聯(lián)性，酚類物質(zhì)的氧化是香菇采后褐變的主要原因，嚴(yán)重影響香菇的商品價(jià)值和外觀品質(zhì)［24］。香菇貯藏期間總酚含量變化如圖2（e）所示，香菇總酚含量均呈下降趨勢，處理組數(shù)據(jù)高于對照組。貯藏期達(dá)到第12 d 時，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總酚含量變化分別為是對照組的114.47%，116.46%，121.41%。貯藏期達(dá)到第20 d 時，5，10，20 mg/mL CMP 溶液處理組香菇總酚含量變化分別為是對照組的113.65%，95.45%，108.55%。結(jié)果表明，20 mg/mL CMP 溶液處理對延緩香菇總酚含量的下降，在貯藏前期具有一定效果（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)CMP 溶液對香菇多酚氧化酶體外酶活具有抑制效果IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL，隨后采用CMP 溶液處理香菇，在低溫貯藏期間對其營養(yǎng)物質(zhì)和外觀品質(zhì)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，CMP 溶液處理香菇可以不同程度地提高低溫條件下香菇的貯藏品質(zhì)，可溶性蛋白含量變化與蘇倩倩等［18］的研究結(jié)果相似，隨著貯藏時間的延長，呈現(xiàn)下降趨勢。香菇還原糖含量呈下降趨勢，是由于子實(shí)體呼吸作用不斷消耗糖類物質(zhì)。處理組維持了較高含量的還原糖最高提升了120.39%，說明CMP 溶液處理香菇可以不同程度的對其呼吸作用產(chǎn)生抑制效果，這與陶璐等［25］采用山楂果膠寡糖處理香菇結(jié)果一致。處理組總糖后期上升的原因，可能是噴灑的外源多糖對香菇內(nèi)源糖源造成的影響。貯藏期間處理組香菇VC 含量變化先下降后上升再維持在一定水平，這與姜天甲［17］的結(jié)果一致。貯藏前期CMP 溶液處理延緩了香菇總酚含量的下降，說明CMP 溶液的抗氧化性及對香菇多酚氧化酶的抑制作用在香菇貯藏前期有效，后期效果不顯著可能是由于香菇自身氧化大于抗氧化能力。CMP 溶液對香菇體內(nèi)酶活活性的影響，還有待測定。

CMP 溶液對香菇PPO 體外活性具有抑制作用，CMP 溶液處理延緩香菇采后可溶性蛋白、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量的下降，同時延緩香菇的感官評定指標(biāo)的下降，貯藏前期對延緩總酚含量下降起到作用，從而提高香菇的貯藏品質(zhì)，延長其貨架期。其中20 mg/mL CMP 溶液處理的效果最好，為CMP 的應(yīng)用發(fā)展提供了一條新途徑和香菇采后保鮮提供了有效的基礎(chǔ)理論與技術(shù)的支撐。