香煙煙霧提取物對BEAS-2B細胞生長及炎癥因子分泌的影響

胡春萌 孫德俊

慢性阻塞性肺病(簡稱慢阻肺)是一種進行性破壞性肺疾病，其特征是持續、不可逆的氣流受限[1-2]。長期香煙煙霧暴露是慢阻肺的主要危險因素，可誘導氣道炎癥反應和上皮細胞凋亡[3]，產生不可逆氣流阻塞以及肺氣腫、可能導致炎性毛細支氣管炎和支氣管炎相關的肺功能障礙[4]。氣道上皮是呼吸系統第一道防御屏障，也是第一個與煙霧直接作用的組織。香煙煙霧誘導的上皮細胞功能障礙，可能是慢阻肺發生的主要因素和早期事件[5]。本研究以香煙煙霧處理人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)，觀察細胞生長、增殖與誘發的炎癥反應情況，探討香煙煙霧暴露對BEAS-2B細胞生長和炎癥因子分泌的影響，為后續探討不同香煙提取物濃度的選擇與作用，以及香煙誘導慢阻肺的機制奠定基礎。

資料與方法

一、材料

BEAS-2B氣道上皮細胞(中國科學院上海細胞庫)，紅梅牌香煙(焦油10mg/支)(紅塔煙草有限責任公司)，DMEM培養基和胎牛血清(Gibco)，CCK-8試劑盒，IL-6、CCL11、MCP-1、IL-13ELISA試劑盒(Elabscience)。

二、方法

1 香煙煙霧提取物制備 制備含3支香煙煙霧的提取物。在串聯的兩個大包氏管內各加入20 mL DMEM吸收液，管的一端連接去掉濾嘴的香煙，另一端則連接一個50 mL的注射器。香煙點燃后，每支煙抽吸次數控制在15次，勻速抽取煙霧直至香煙燃盡，輕輕搖晃玻璃瓶使煙霧充分溶解。將收集到的液體移入離心管中，過濾后調整其PH為7.4，測OD320 nm～OD540 nm值在0.9～1.2之間，即為100% CSE原液，于4℃保存，備用。實驗所需的不同濃度CSE溶液，用相應體積的無血清培養基稀釋，配制好不同濃度的CSE須在30 min內用于實驗。

2 細胞培養及傳代 將BEAS-2B細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養于37℃、5% CO2細胞培養箱，當細胞生長達80%以上融合狀態時進行傳代。收集對數期的BEAS-2B細胞，調整細胞懸液濃度，使用血球計數板進行細胞計數，以105個/每孔的密度接種于六孔板中，在培養箱中培養至細胞生長達80%以上時，棄掉培養基，在每六孔板細胞中分別加入3 mL的0.1%，1%,3% 濃度的香煙煙霧提取物的培養基，同時設立對照組。

3 繪制BEAS-2B細胞生長曲線 將不同濃度CSE處理24 h，48 h，72 h后的六孔板細胞以5000細胞數分別接種于96孔板，分組為對照組，0.1%CSE，1%CSE,3%CSE，并設不接種細胞的空白組，每組6個復孔，加入含血清的培養基繼續培養，隔天換液。每隔24 h加入10 μL CCK-8溶液培養2 h，隨后經酶標儀檢測各樣本在450 nm處的OD值，連續測7 d。檢測不同時間、不同濃度CSE處理后BEAS-2B細胞生長情況，繪制細胞生長曲線。

4 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數生長期細胞以5000細胞數接種于96孔板，將細胞分為對照組，0.1%CSE，1%CSE,3%CSE四組，每組6個復孔，在不同濃度CSE處理后的24 h，48 h，72 h加入CCK-8溶液，檢測各樣本在450 nm處的OD值，計算細胞存活率。[細胞存活率=(試驗組 A 值-空白組 A 值)/(對照組 A 值-空白組 A 值)×100%]。

5 酶聯免疫吸附劑檢測BEAS-2B細胞中炎癥因子表達 收集不同濃度CSE處理24 h、48 h、72 h后的細胞上清液，用ELISA試劑盒測定IL-6、CCL11、MCP-1、IL-13的含量，具體操作方法按照試劑盒說明書進行，每組處理設置3個復孔，各組試驗均獨立重復三次。

三、統計學方法

結 果

一、不同濃度香煙煙霧對BEAS-2B細胞生長影響

將0.1%CSE、1%CSE、3%CSE處理24 h、48 h、72 h后的BEAS-2B細胞連續檢測7 d，繪制細胞生長曲線(圖1)。細胞整體呈持續生長的趨勢，3%CSE處理24 h和48 h后對細胞生長有明顯的抑制作用，隨著處理時間增長，細胞抑制減弱；72 h的CSE對細胞生長幾乎沒有影響。

圖1 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞生長影響

二、不同濃度香煙煙霧對BEAS-2B細胞活性影響

用0.1%CSE、1%CSE、3%CSE直接處理BEAS-2B細胞24 h、48 h、72 h后，通過CCK8檢測細胞增殖能力(圖2)。不同濃度CSE處理24 h后與對照組相比細胞活性沒有影響；3%CSE處理組48 h與72 h后細胞活性較對照組均顯著降低，差異具有統計學意義(48 h：P<0.001，72 h：P<0.01)。

圖2 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞活性影響

三、不同濃度CSE對BEAS-2B細胞分泌炎癥介質水平的影響

(圖3)中，在BEAS-2B細胞上清液24 h，48 h 3%CSE處理組中IL-6表達量與對照組相比降低，差異具有統計學意義(24 h：P<0.05，48 h：P<0.01)。分別處理24 h 、48 h和72 h 時，3%CSE處理組中CCL-11表達水平與對照組相比降低，差異具有統計學意義(24 h：P<0.01，48 h：P<0.001，72 h：P<0.001)(圖4)。3%CSE處理組持續處理24 h、48 h和72 h 時MCP-1表達量與對照組相比降低，差異具有統計學意義(24 h：P<0.01，48 h：P<0.001，72 h：P<0.001)(圖5、6)。BEAS-2B細胞上清中IL-13在各組間的表達無顯著差異(圖6)。

圖3 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞分泌IL-6水平的影響

圖4 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞分泌CCL-11水平的影響

圖5 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞分泌MCP-1水平的影響

圖6 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞分泌IL-13水平的影響

討 論

吸煙是慢阻肺的重要危險因素。香煙煙霧通過口腔進入氣道，氣道上皮作為機體的重要屏障，持續處于炎癥浸潤、組織損傷和細胞死亡等狀態下，成為慢阻肺致病的主要因素[6]。慢阻肺是重大慢性呼吸系統疾病，其致死亡率在全球死因排行榜中排名第三。慢性支氣管炎或近端氣道產生過多粘液、肺氣腫或周圍肺組織破壞和肺泡附著物喪失以及伴隨著炎癥和氣道重塑的小氣道功能障礙，是慢阻肺的重要病理特征[7]。持續攝入香煙煙霧引發的氣道炎癥，即使在戒煙多年后仍會持續出現，而這一現象對于吸煙的慢阻肺患者尤為明顯，直接表現為氣道炎癥反應水平加劇，持續時間延長。上述病理過程涉及機體的先天免疫系統和適應性免疫系統[8]。一項病例-對照研究發現，慢阻肺與吸煙總量之間存在顯著的劑量-反應關系[9]，患慢阻肺的風險隨著吸煙總量的增加而增加，該效應與長期持續攝入香煙煙霧引發的氣道炎癥、損傷與細胞凋亡等有直接關系。然而，香煙煙霧對于氣道的影響與危害是否呈劑量依賴或者時間依賴作用，目前尚無報道。本研究通過設置CSE的不同濃度和處理時間等條件處理BEAS-2B細胞，在體外證明香煙煙霧影響細胞生長與增殖，抑制IL-6、CCL-11和MCP-1炎癥介質釋放。隨著CSE處理時間增長，細胞增殖呈減緩趨勢，抑制作用與對照組相比不顯著。這可能是因為細胞體外培養時間長，影響其正常生長或建立了耐受，有待于進一步研究。同時，發現BEAS-2B細胞在3%CSE濃度處理48 h與72 h后，細胞活性較對照組均顯著降低，此數據為使用香煙煙霧誘導的BEAS-2B細胞炎癥模型提供劑量和處理時間等條件的參考。

本研究中，重點關注IL-6、IL-13、CCL11和MCP-1的表達情況。IL-6是一種多功能糖蛋白構成的炎癥因子，在多種基質細胞和免疫細胞中產生，與多種系統的炎性疾病密切相關[10]。IL-6分泌增加，能夠上調局部免疫反應，并誘導全身釋放類似物，但通過體外抑制巨噬細胞釋放TNF抑制炎癥反應。IL-6是慢阻肺的重要炎癥指標，與氣流限制和肺氣腫病程進展具有強相關[11]。研究表明，氣管內直接灌注IL-6可消除脂多糖引起的肺損傷與肺部炎癥作用[12]。支氣管肺泡巨噬細胞是機體抵御病原體的重要防線。在病原體侵入機體時，巨噬細胞釋放的IL-6是肺部防御的早期反應[13]。McCrea等人驗證了具有抗炎作用的細胞因子IL-6，在吸煙者肺部的表達減少[14]。這與本實驗中香煙煙霧降低IL-6在BEAS-2B細胞中的表達結果一致。Eotaxin-1 (CCL11)具有嗜酸性粒細胞趨化作用，通常與哮喘相關[15]，Eotaxin和Eotaxin受體(CCR3)陽性細胞在慢性支氣管炎急性加重和哮喘中，表達升高；在50名FORTE試驗[16]研究參與者(34名穩定期受試者和16名快速進展期受試者)和11名對照組中，血漿eotaxin-1在快速進展期受試者中低于穩定期慢阻肺患者，穩定期慢阻肺受試者中Eotaxin-1也顯著低于正常對照組[17]。但另一項研究發現，慢阻肺患者的Eotaxin高于對照組，轉錄因子NF-κβ和GCR-α上調該細胞因子的產生[18]。慢阻肺患者的Eotaxin水平表達趨勢在不同報道中具有顯著差異。本實驗通過體外實驗，證明CCL11在香煙煙霧誘導的細胞模型中表達水平降低。Eotaxin-1的變化提示肺內T淋巴細胞和嗜酸性粒細胞轉運的改變，可能是影響慢阻肺穩定性的重要因素，細胞介導的免疫反應，對慢阻肺的臨床狀態有重要影響。Eotaxin-1水平可作為評估慢阻肺患者病程的潛在標志物。單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)是一種β趨化因子，主要由巨噬細胞產生。可誘導人單核細胞/巨噬細胞、小鼠肥大細胞和人T淋巴細胞亞群的趨化[19]。MCP-1在多種組織中表達，還在巨噬細胞、內皮細胞、支氣管上皮細胞和平滑肌細胞中表達[20]，是過敏性炎癥的關鍵炎癥介質，通過誘導肥大細胞激活和白三烯C4釋放，導致氣道高反應性[21]。Cevit等人發現MCP-1表達與哮喘患者氣道炎癥嚴重程度呈正相關[22]。在吸煙的慢阻肺患者的痰液中，MCP-1水平明顯高于非吸煙者和吸煙的健康對照者；在慢阻肺患者血漿中MCP-1水平高于健康對照組[23]。研究發現MCP1表達在BEAS-2B細胞的過敏性炎癥反應中明顯上調[24]，因此，對于過敏性炎癥反應，MCP1具有重要作用，其表達模式已明確，而對于非過敏性炎癥反應中，其表達特征與模式還有待探討。本研究通過香煙煙霧誘導體外炎癥模型，發現MCP-1表達降低。

香煙煙霧提取物，降低支氣管上皮細胞的生長活性，改變炎癥因子的表達，可導致慢阻肺的發生發展。在吸煙者中，促炎因子的過度表達和抗炎過程水平的不足，可能導致未抑制的炎癥和發展為阻塞性氣道疾病的風險。肺部促炎細胞因子和抗炎細胞因子水平的改變可能在持續暴露于香煙煙霧的人的炎癥性氣道疾病的發展中起重要作用，也更容易受到其影響。進一步的研究評估與阻塞性氣道疾病發展相關的產生炎性細胞因子和炎性細胞趨化劑的細胞成分，將有助于更好地理解這些疾病過程。本研究具有一定局限性，香煙煙霧提取物沒有可靠的標準品，目前關于香煙煙霧提取物相關研究均來自于實驗室通過香煙自制的，雖然本研究將自制的提取物進行質控與定量標記，但是其作用還受到香煙品牌、焦油含量等影響。香煙煙霧提取物的質控與劑量標記，極大影響數據的穩定性與實驗結論的可靠性，這也是發表文章中結果不一致的部分原因。希望可以出現一款具有代表性的可靠的香煙煙霧提取物標準品，為建立體外細胞模型提供保障。