血清內(nèi)皮功能標(biāo)記物甲基化精氨酸與嬰幼兒喘息性疾病的相關(guān)性研究

張淑琴 易陽(yáng) 張?chǎng)╂?/p>

喘息性疾病是嬰幼兒期常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，主要由毛細(xì)支氣管炎和哮喘組成。兒童毛細(xì)支氣管炎與哮喘有類(lèi)似的免疫學(xué)基礎(chǔ)[1-4]，目前兩者在臨床上缺乏有效的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)和區(qū)分。兒童喘息類(lèi)疾病，往往伴隨以氣道中炎癥因子分泌增加、氣道血管新生異常和重構(gòu)為特征的血管內(nèi)皮功能障礙[5]。不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA)不但是內(nèi)皮功能的經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因子，還是哮喘狀態(tài)下潛在的氣道標(biāo)記物及新的治療靶標(biāo)[6]，其同分異構(gòu)體對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(SDMA)可競(jìng)爭(zhēng)性與陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(CATs)競(jìng)爭(zhēng)，抑制L-精氨酸的攝取，從而造成血管內(nèi)皮損傷[7]。目前，有關(guān)精氨酸甲基化與嬰幼兒期喘息類(lèi)疾病的病理生理關(guān)聯(lián)尚不明確。本文擬通過(guò)考察嬰幼兒喘息性疾病血清中ADMA和SDMA的水平對(duì)此進(jìn)行探索。

資料與方法

一、一般資料

所有病例來(lái)源于本院呼吸科住院部或門(mén)診，正常健康兒童為對(duì)照組。共納入對(duì)照組18例，男9例，年齡3～12月，平均年齡7.17±2.66月；肺炎組22例，男12例，年齡2～17月，平均年齡6.72±4.21月；毛支組18例，男10例，年齡2～16月，平均年齡5.50±2.77月；哮喘組16例，男9例，年齡9～22月，平均年齡14.43±3.78月。各組男女比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，對(duì)照組、肺炎組、毛支組年齡無(wú)顯著差異，哮喘組平均年齡大于其他三組(P<0.001)。對(duì)毛支組和哮喘組進(jìn)行為期1年的跟蹤隨訪(fǎng)，記錄一年之內(nèi)喘息、咳嗽(使用支氣管擴(kuò)張劑改善)次數(shù)，以此為主要的預(yù)后指標(biāo)。

5歲以下兒童哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：分別為：(1)喘息累計(jì)發(fā)作頻率≥4次；(2)存在可逆性氣流受限(包括霧化吸入SABA 治療有效，或經(jīng)4～8 周ICS 抗哮喘治療有效)；(3)個(gè)人過(guò)敏史；(4)一級(jí)親屬過(guò)敏史；(5)體內(nèi)外變應(yīng)原檢測(cè)陽(yáng)性。 根據(jù)各參數(shù)的相關(guān)強(qiáng)度分別賦予“3-3-1-1-1”，累計(jì)分?jǐn)?shù)達(dá)到4分以上診斷為哮喘。本研究經(jīng)常州市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)同意(常兒醫(yī)倫理審查(科研)2016-004)，且征得參與者家屬知情同意。

二、方法

血清ADMA、SDMA和L-精氨酸的檢測(cè)方法：所有參與者于入院時(shí)留取全血樣本，3500rpm×10 min離心后儲(chǔ)藏于-80℃冰箱中待用。血清中ADMA、SDMA和L-精氨酸用此前建立的基于柱前衍生化-高效液相色譜(HPLC)分離-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)檢測(cè)的方法進(jìn)行檢測(cè)[9]。

主要儀器與裝置：Finnigan TSQ-4000 TSQ Quantum Access液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(Thermo Fisher, USA)，配有LC-20AD液相色譜泵，DGU-20A3在線(xiàn)脫氣機(jī)， SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，ESI接口離子源，Xcalibur色譜工作站。超純水機(jī)：(Milli-Q A10, USA)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5430R，德國(guó))。主要試劑：ADMA、SDMA，L-精氨酸和內(nèi)標(biāo)高精氨酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。

血清樣品前處理：血清于室溫解凍后以超純水以1 ∶3稀釋后內(nèi)標(biāo)homo-精氨酸溶液(500 μM)，加入乙腈混勻3 min以充分沉淀蛋白后以15000g進(jìn)行10 min離心。上清于80℃水浴中空氣吹干后加入以4:1的比例加入1 mol/L鹽酸正丁醇作為柱前衍生化試劑，然后以65℃水浴溫孵15 min。此后揮干衍生化試劑，后以100 μL超純水復(fù)溶樣品，15000g×10 min離心兩次，取5 μL進(jìn)樣。

色譜條件：島津5.0 μm ODS C18色譜柱(日本)，柱溫：40℃；流動(dòng)相A：甲醇；B：醋酸銨水溶液(10 mM, pH4.0)。梯度洗脫條件： 0～3 min, 18% A; 3～3.1 min, 18%～60% A; 3.1～5.5 min, 60% A; 5.5～5.6 min, 60～18% A。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管溫度：380℃；電離電壓：4.5kV；霧化氣和氣簾氣：氮?dú)猓?0 L/min；輔助氣：氮?dú)猓?0 L/min；監(jiān)測(cè)模式：SRM；掃描方式：正離子掃描。母離子/子離子：ADMA, 259/214, 20 eV; SDMA, 259/228, 20 eV; L-精氨酸, 231/70, 20 eV; homo-精氨酸, 245/84, 15 eV。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、對(duì)照組、肺炎組、細(xì)支氣管炎組、哮喘組血清精氨酸甲基化代謝物濃度(見(jiàn)表1)。

表1 對(duì)照組、肺炎組、毛支組和哮喘組血清L-精氨酸、ADMA、SDMA比較

二、毛細(xì)支氣管炎和哮喘隨訪(fǎng)情況

共34例，12例失訪(fǎng)，22例隨訪(fǎng)成功，隨訪(fǎng)成功率64.7%。通過(guò)1年隨訪(fǎng)結(jié)果顯示，1年內(nèi)出現(xiàn)至少1次反復(fù)咳嗽或喘息的哮喘和毛細(xì)支氣管炎參與者(隨訪(fǎng)B組，n=7)急性期血清ADMA水平顯著高于隨訪(fǎng)中沒(méi)有出現(xiàn)反復(fù)咳嗽或喘息的參與者(隨訪(fǎng)A組，n=15)血清中的水平(0.74±0.14 μMvs0.58±0.14 μM,P<0.05)， ROC分析AUC=0.829 (0.649～1.008)，P<0.05；兩組SDMA水平?jīng)]有顯著差別，同時(shí)ROC曲線(xiàn)AUC=0.619(0.300～0.939),P>0.05。該結(jié)果表明，嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和哮喘急性發(fā)作期血清ADMA水平的增高與后期發(fā)生反復(fù)咳嗽或喘息有顯著相關(guān)性，ADMA是預(yù)測(cè)反復(fù)喘息的生物標(biāo)志物(見(jiàn)圖1)。

圖1 A組：1年隨訪(fǎng)期內(nèi)未出現(xiàn)反復(fù)咳嗽或喘息；B組：1年隨訪(fǎng)期內(nèi)至少出現(xiàn)1次反復(fù)咳嗽或喘息注：*：隨訪(fǎng)B組急性期血清ADMA水平顯著高于隨訪(fǎng)A組(0.74±0.14 μM vs 0.58±0.14 μM), P<0.05

討 論

哮喘為慢性氣道炎癥，精氨酸甲基化產(chǎn)物ADMA與氣道炎癥和高反應(yīng)性有關(guān)[10]。ADMA是全身蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的一種代謝物，主要來(lái)源于氣道上皮[11]，是NOS的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)抑制劑, 對(duì)NOS的三種亞型eNOS、nNOS和iNOS均有顯著的抑制作用，是NO平衡的一個(gè)重要因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明外源性ADMA可引起氣道高反應(yīng)性，增加膠原蛋白的形成，并誘發(fā)小鼠的可逆性纖維化[12]。另有研究表明較高的ADMA對(duì)NO的平衡有不利影響，氣道阻力和ADMA之間呈正相關(guān)，可導(dǎo)致哮喘的不良后果[13]。Th2細(xì)胞因子IL-4能顯著下調(diào)支氣管上皮細(xì)胞中二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(DDAH2)水平，使ADMA的降解代謝下降而造成ADMA的大量累積，以及由此產(chǎn)生缺氧應(yīng)激導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體丟失[14]。因此，ADMA水平與哮喘有密切相關(guān)性，但是在嬰幼兒中的研究相對(duì)較少。

在哮喘和COPD等慢性氣道疾病中，精氨酸酶表達(dá)升高會(huì)導(dǎo)致氣道收縮、高反應(yīng)、炎癥及重塑等一系列反應(yīng)。精氨酸酶和NOS表達(dá)水平及其活性的改變，在哮喘或COPD等各種氣道疾病的發(fā)展中起著核心作用[15]。研究顯示，哮喘急性發(fā)作病人線(xiàn)粒體功能障礙與血漿內(nèi)源性ADMA 濃度升高密切相關(guān)。 ADMA導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙可能與NO生成減少，氧化應(yīng)激增加，線(xiàn)粒體生物合成受到抑制有關(guān)[16]。哮喘和毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒最常見(jiàn)的喘息性疾病，兩者發(fā)病機(jī)制相似[17]，具有高度的異質(zhì)性，80%以上的哮喘起始于嬰幼兒階段，臨床對(duì)嬰幼兒喘息性疾病進(jìn)行早期識(shí)別、評(píng)估和管理仍極具挑戰(zhàn)性，臨床仍缺乏生物學(xué)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)。

本研究表明，嬰幼兒哮喘急性期血清ADMA濃度較對(duì)照組、肺炎組增高，與毛細(xì)支氣管炎沒(méi)有明顯差異(P=0.094)。研究表明，在病毒和細(xì)菌感染后不久，肺部巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞中iNOS上調(diào)，導(dǎo)致NO生產(chǎn)、NO代謝物和ADMA水平增加[18]，NO已被證明可抑制人類(lèi)Th17細(xì)胞的增殖[19]。在哮喘病人中，已經(jīng)觀察到局部和全身的iNOS、精氨酸酶、ADMA和精氨酸水平與肺功能和哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)[9，20]。哮喘患者[21]和不同的過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型[22]的基因關(guān)聯(lián)研究表明，精氨酸酶在疾病的不同方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。較高的精氨酸水平和精氨酸/ADMA比值，都與較低的CCL-20和TNF-α有關(guān)[23]，CCL-20是CCR6的配體，通過(guò)免疫細(xì)胞增強(qiáng)Th17介導(dǎo)的炎[24],補(bǔ)充精氨酸可通過(guò)誘導(dǎo)精氨酸酶的活性抑制TNF-α的合成[25]，本研究中AMI在毛細(xì)支氣管炎組和哮喘組高于正常對(duì)照組，提示其免疫炎性反應(yīng)的異常，可能是炎性反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)記物。盡管本研究中哮喘組兒童平均年齡高于其他組，但考慮ADMA隨著年齡血清濃度是下降的[26]，如去除年齡影響因素，更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨訪(fǎng)一年中發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎和哮喘患者中，發(fā)生至少1次反復(fù)咳嗽或喘息者其血清中的ADMA水平顯著高于未發(fā)生反復(fù)咳嗽或喘息者，ROC分析AUC=0.829 (0.649～1.008)，(P<0.05)，表明血清ADMA是該群體中預(yù)測(cè)發(fā)生喘息的標(biāo)記物。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎、毛細(xì)支氣管炎和哮喘嬰幼兒血清SDMA均明顯高于正常組(P<0.001)，但組間沒(méi)有差異。盡管SDMA間接影響NO水平，但與ADMA相比影響較少。研究表明高SDMA水平與ICU中收治的危重癥患者的短期和長(zhǎng)期死亡率有關(guān)，其中敗血癥患者SDMA水平最高，提示SDMA可能與感染相關(guān)[27]。本研究中沒(méi)有納入重癥病例，SDMA是否參與嬰幼兒呼吸道感染這一共同的病理進(jìn)程尚證據(jù)不足。

綜上，精氨酸甲基化過(guò)程參與嬰幼兒喘息類(lèi)疾病的生理病理進(jìn)程，ADMA可能是嬰幼兒哮喘的生物學(xué)記物，毛細(xì)支氣管炎和哮喘急性期血清ADMA水平升高可能是其發(fā)生反復(fù)咳嗽或喘息的預(yù)測(cè)標(biāo)記物，但其特異性和敏感性需更多的試驗(yàn)進(jìn)一步探索。在本研究中樣本數(shù)偏少，失訪(fǎng)率較高，隨訪(fǎng)時(shí)間較短，在以后中需加大樣本量進(jìn)一步研究。