MiR-27b-3p通過下調lncRNA ST7-AS1水平調控非小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡和侵襲

趙麗霞 任成波 趙峻峰

肺癌是世界范圍內與死亡率相關的主要腫瘤類型，包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，NSCLC占所有肺癌患者的80%以上[1]。NSCLC不容易診斷，大多數(shù)患者確診即為中晚期，不適合手術治療[2]。因此研究其發(fā)病機制已成為早期發(fā)現(xiàn)和早期治療的重要問題。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是在物種間高度保守的非編碼RNA[3]。人類基因組中有許多miRNAs參與腫瘤的增殖、分化等多種細胞過程[4]。近幾年，miRNAs與肺癌，尤其是與NSCLC之間的關聯(lián)已經成為多項研究的焦點，如miR-512-5p可通過下調其靶基因抑制NSCLC細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡[5-6]。有研究表明，miR-27b-3p在NSCLC組織和細胞系中的表達均顯著降低，調控其表達可影響NSCLC生長和侵襲，是NSCLC的潛在治療靶點[7]。然而，miR-27b-3p在NSCLC中的作用尚未完全了解。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種不具備編碼能力的RNA分子，在細胞內可通過多種分子機制調節(jié)不同的生物學過程。有研究表明，lncRNA ST7-AS1是胃癌、宮頸癌等多種癌癥的致癌lncRNA[8-9]。據(jù)報道，lncRNA ST7-AS1在肺腺癌組織和細胞中上調，可促進腫瘤細胞的多種惡性表型[10]，但其在NSCLC腫瘤發(fā)生中的調控機制尚不清楚。本研究旨在探究miR-27b-3p對NSCLC細胞增殖、凋亡及侵襲的作用，并初步探究lncRNA ST7-AS1在此過程中發(fā)揮的作用，以期為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

資料與方法

一、 細胞、主要試劑與儀器

人正常肺上皮BEAS-2B細胞(HT-X2075C)和人NSCLC細胞系A549(HT-X1707)、H358(HT-X1703)、H1299(HT-X1713)、NCL-H2073(HT-X2743C)均購自深圳華拓細胞庫；miR-27b-3p模擬物(miR-27b-3p mimic)和miR-27b-3p模擬物陰性對照(NC mimic)、lncRNA ST7-AS1過表達載體(lncRNA ST7-AS1-pcDNA3.1)和lncRNA ST7-AS1過表達空載(pcDNA3.1)、miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1定量引物均由上海GenePharma公司設計并合成。miRNeasy Mini試劑盒(217004)購自德國QIAGEN；TRIzol總RNA提取試劑(15596026)、LipofectamineTM 2000轉染試劑(1668019)購自美國Invitrogen；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(RR420A)購自日本Takara；細胞總蛋白提取試劑盒(BC3790)、MTT細胞增殖檢測試劑盒(M1020)購自北京Solarbio；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(DD1205-01)、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(A211-01)購自南京Vazyme；Transwell小室(3422)、Matrigel(356255)購自美國Corning。

NanoDrop2000微量紫外分光光度計、Multiskan FC酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific；PRISM 7500 qRT-PCR系統(tǒng)購自美國ABI；GelDoc EZ全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad；GX53倒置顯微鏡購自日本Olympus；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Backman。

二、 方法

1 細胞培養(yǎng)與分組 人正常肺上皮BEAS-2B細胞和人NSCLC細胞系A549、H358、H1299、NCL-H2073均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10%滅活的FBS，在5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃。當細胞融合度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)，使用傳代3次以上的對數(shù)期生長的細胞進行后續(xù)實驗。

將A549細胞分為5組：Control組(正常培養(yǎng))、NC組(轉染NC mimic)、miR-27b-3p組(轉染miR-27b-3p mimic)、miR-27b-3p+VC組(共同轉染miR-27b-3p mimic和pcDNA3.1)、miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組(共同轉染miR-27b-3p mimic和lncRNA ST7-AS1-pcDNA3.1)，根據(jù)Lipofectamine TM 2000轉染試劑的說明書進行轉染操作，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2 qRT-PCR檢測細胞中miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1表達水平 根據(jù)miRNeasy Mini試劑盒說明書，通過TRIzol提取按照上述方法培養(yǎng)的BEAS-2B、A549、H358、H1299及NCL-H2073細胞和各組處理的A549細胞總RNA，通過NanoDrop2000微量紫外分光光度計檢測，提取RNA的濃度和純度。通過qRT-PCR系統(tǒng)和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增。分別以U6、β-actin為內參基因，通過溶解度曲線，評價PCR結果的可靠性，得到循環(huán)闕值(Threshold Cycle，Ct)，通過2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達。

miR-27b-3p引物序列：上游：5′-TTATGCCCAGCGATGACC-3′，下游：5′-GGCTCCAACTTAACTGTCCC-3′；lncRNA ST7-AS1引物序列：上游：5′-TGGGGTAACTCAAAAAGCCTG-3′，下游：5′-GGTTCATACCAGCCCTGTCC-3′；U6引物序列：上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-TTCGACAGTCAGCCGCATCTT-3′，下游：5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3′。

3 雙熒光素酶報告基因檢測miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1靶向關系 Starbase網站用于預測miR-27b-3p在lncRNA ST7-AS1的結合位點，分別構建了含有miR-27b-3p結合位點的lncRNA ST7-AS1野生型(lncRNA ST7-AS1-WT)和突變型(lncRNA ST7-AS1-MUT)熒光素酶報告載體。使用LipofectamineTM 2000將miR-27b-3p mimic或NC mimic(miR-27b-3p mimic組、NC mimic組)和lncRNA ST7-AS1-WT或lncRNA ST7-AS1-MUT轉染A549細胞48 h，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書方法，檢測熒光素酶活性。

4 MTT法檢測各組A549細胞增殖活力 將按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細胞以5×103個/孔的密度平鋪于96孔板中，48 h后向每孔中添加20 mL MTT試劑后孵育4 h。使用多功能酶標儀檢測每個孔在490 nm處的光密度值(OD值)。

5 流式細胞儀檢測各組A549細胞凋亡率 收集按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細胞，使用PBS洗滌后制備單細胞懸浮液(1×106個/mL)，吸取100 mL細胞懸浮液于96孔板中，加入5 mL Annexin V-FITC，4℃避光孵育30 min。然后，加入5 mL碘化丙啶(PI)，輕輕混合并在室溫下孵育5 min。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

6 Transwell測定各組A549細胞侵襲情況 Transwell小室使用Matrigel包被后在37℃下孵育30 min，直到Magtrigel固化。將按照上述方法培養(yǎng)的各組A549細胞使用無血清的培養(yǎng)基懸浮，制備形成5×104個/mL的細胞懸浮液，吸取500 mL添加Transwell小室上室中，同時在下室添加700 mL正常培養(yǎng)基，在37℃孵育24 h，去除Transwell小室上表面細胞，使用PBS清洗小室后在預冷的甲醇中浸泡30 min，將細胞固定在Transwell小室底部，添加0.1%結晶紫染色10 min。使用倒置顯微鏡拍攝圖像，并統(tǒng)計轉移至底部室的細胞(侵襲細胞數(shù)量)。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件處理記錄的數(shù)據(jù)。測量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以平均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗方法。P<0.05，表明存在顯著統(tǒng)計學差異。

結 果

一、 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1在NSCLC細胞系中的表達情況

通過分析qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)，與人正常肺上皮細胞BEAS-2B比較，miR-27b-3p在人NSCLC細胞系(A549、H358、H1299、NCL-H2073)中表達顯著降低，且在A549中表達明顯低于其他NSCLC細胞系(圖1A，P均<0.05)；lncRNA ST7-AS1的表達呈現(xiàn)相反的趨勢，lncRNA ST7-AS1表達水平在正常肺上皮細胞BEAS-2B中表達最低，且在A549中表達明顯高于其他NSCLC細胞系(圖1B，P均<0.05)。綜上，后續(xù)選擇A549進行研究。

圖1 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1在NSCLC細胞中的表達

二、 miR-27b-3p和lncRNA ST7-AS1靶向關系驗證

Starbase網站預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA ST7-AS1與miR-27b-3p存在靶標結合位點(圖2A)，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，與轉染lncRNA ST7-AS1-WT的NC mimic組比較，轉染lncRNA ST7-AS1-WT的miR-27b-3p mimic組A549細胞中熒光素酶活性顯著降低(圖2B，P<0.05)；而轉染lncRNA ST7-AS1-MUT的NC mimic組和miR-27b-3p mimic組A549細胞中熒光素酶活性變化無顯著差異(圖2B，P>0.05)。

圖2 miR-27b和lncRNA ST7-AS1靶向關系驗證

三、 各組A549細胞中miR-27b-3p、lncRNA ST7-AS1表達水平和細胞增殖活力變化情況

與NC組比較，miR-27b-3p組A549細胞中miR-27b-3p表達水平增高，lncRNA ST7-AS1表達水平降低，細胞增殖活力降低(P均<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組A549細胞中miR-27b-3p表達水平降低，lncRNA ST7-AS1表達水平增高，細胞增殖活力增高(P均<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組細胞中，miR-27b-3p、lncRNA ST7-AS1表達水平和細胞增殖活力變化無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見圖3)。

圖3 各組A549細胞中miR-27b、lncRNA ST7-AS1表達水平和細胞增殖活力變化情況

四、 各組A549細胞凋亡率變化情況

(見圖4)所示：與NC組比較，miR-27b-3p組細胞凋亡率增高(P<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組細胞凋亡率降低(P<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組細胞凋亡率變化無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖4 各組A549細胞凋亡率變化情況

五、 各組A549細胞侵襲變化情況

(見圖5)所示：與NC組比較，miR-27b-3p組侵襲細胞數(shù)量減少(P<0.05)；與miR-27b-3p+VC組比較，miR-27b-3p+lncRNA ST7-AS1組侵襲細胞數(shù)量增多(P<0.05)；而NC組和Control組、miR-27b-3p+VC組和miR-27b-3p組侵襲細胞數(shù)量變化無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖5 各組A549細胞侵襲變化情況

討 論

肺癌不僅是最常見的惡性腫瘤之一，也是所有癌癥中發(fā)病率和死亡率最高的[11]。在中國，隨著老齡化人口規(guī)模的增加、生活方式的改變以及經濟和環(huán)境因素的影響，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢[12]。NSCLC極具隱匿性，大多數(shù)患者確診即為中晚期，不適合手術治療。盡管近幾年醫(yī)療技術有所提高，但NSCLC患者的早期診斷、綜合管理和預后仍不理想[13]。因此，探究有效的診斷和治療方法是控制NSCLC的重中之重。

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs介導的靶基因的異常表達參與了許多病理過程。miRNAs編碼區(qū)往往位于脆弱的基因組區(qū)域，腫瘤中容易發(fā)生基因擴增或缺失[14]。多項研究也證實腫瘤細胞系和腫瘤組織中存在大量異常表達的miRNAs，這些miRNAs調控的許多靶基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[15]。因此，探究miRNAs介導的靶基因及其相關信號通路，有助于理解NSCLC的分子機制，促進新治療策略的開發(fā)。本研究通過探究miR-27b-3p在NSCLC中的表達和調節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在NSCLC細胞系中低表達，且在A549細胞中表達最低，故后續(xù)選擇A549細胞作為研究對象。進一步研究顯示，上調miR-27b-3p表達可顯著抑制NSCLC A549細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)表明了miR-27b-3p在NSCLC中起到腫瘤抑制作用。事實上，其他研究亦表明miR-27b-3p在人類癌癥中發(fā)揮抑制作用，如，Miao等[16]研究表明，miR-27b-3p在神經膠質瘤組織和細胞中下調，過表達的miR-27b-3p可抑制細胞增殖和遷移，并誘導細胞凋亡，進而抑制腫瘤的進展，且在體內過表達亦可抑制異種移植瘤的生長；Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在食管癌組織和細胞中表達降低，miR-27b-3p的下調表達與細胞分化差、TNM分期和淋巴結轉移有關，上調其表達可顯著抑制細胞增殖、遷移和上皮間質轉化。與miR-27b-3p在某些人類癌癥中的抑制作用相反，還發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p在三陰性乳腺癌、結直腸癌等癌細胞中的表達增加，如，Shen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p在三陰性乳腺癌中上調，并通過調節(jié)PPARG和上皮間質轉化促進腫瘤的進展和轉移；Yang等[19]研究表明，miR-27b-3p可通過靶向HOXA10促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲。這些結果表明，由于不同腫瘤微環(huán)境中的不同靶基因，miR-27b-3p的具體作用是腫瘤特異性的，因此闡明miR-27b-3p表達的分子機制至關重要。

隨著lncRNA在各種腫瘤中作為抑癌基因或癌基因越來越受到關注，lncRNA可作為治療分子靶點或具有預后價值的潛在生物標志。而LncRNA ST7-AS1是新發(fā)現(xiàn)的位于7q31.2的LncRNA，具有拷貝數(shù)變異(CNVs)，可導致下游癌癥中的基因紊亂，與腫瘤生物學過程中的增殖、凋亡和細胞遷移密切相關[20-21]。有研究表明，LncRNA ST7-AS1表達水平與癌癥患者的總生存期相關，并在多種癌癥(包括肺腺癌、乳腺癌等)的臨床病例特征和不良預后相關[10，22]。本研究證實lncRNA ST7-AS1被miR-27b直接靶向下調，且miR-27b可能通過抑制NSCLC細胞A549中l(wèi)ncRNA ST7-AS1表達抑制細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡，同時上調lncRNA ST7表達可逆轉此過程，因此，lncRNA ST7-AS1是開發(fā)新型抗NSCLC策略的一個有吸引力的目標。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ST7-AS1很有可能是miR-27b-3p的新型靶標基因，miR-27b通過下調lncRNA ST7-AS1表達抑制NSCLC細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡，該發(fā)現(xiàn)可能有助于揭示該疾病發(fā)生和惡性進展的分子機制。然而，lncRNA ST7-AS1直接或間接調控NSCLC的形成仍需研究，此外，NSCLC的形成是一個極其復雜的發(fā)展過程，僅在單一細胞系中研究不具有普遍性，后續(xù)仍需要在動物模型及更多細胞系中進行更進一步的探究。