電針對WKY抑郁模型大鼠行為學(xué)及前額葉皮質(zhì)GLUR1、NR2B蛋白表達的影響

李曉慧,秦麗娜,邢龍飛,黃樹航,馮榮榮

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100020;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

抑郁癥作為一種臨床多見的精神障礙性疾病,常表現(xiàn)為情緒低落、缺乏活力、悲觀、睡眠障礙等癥狀[1],具有持續(xù)性、反復(fù)性等發(fā)病特點,嚴重損害了患者正常的社會和職業(yè)功能[2]。世界衛(wèi)生組織公布抑郁癥已經(jīng)影響約3億人,至2017年已成為全球致殘的主要原因[3-4],此外,抑郁癥患者自殺念頭也成為了該病死亡率高的主要原因。抑郁癥已然成為了一個日益嚴重的公共健康問題。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方法以藥物治療最為廣泛,傳統(tǒng)的抗抑郁藥物雖然有較好的治療效果,但其起效時間較長,許多抑郁癥患者對藥物易產(chǎn)生耐受,且具有較大的副作用,因此,抗抑郁藥物并未達到理想的治療效果[5]。關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機制有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)、免疫及細胞因子失調(diào)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子失調(diào)、突觸可塑性失調(diào)等學(xué)說,其中,突觸可塑性近年越來越受到學(xué)界重視,有助于揭示抗抑郁的新靶點[6]。本研究采用普遍存在抑郁樣行為的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,觀察電針百會、印堂穴對WKY抑郁大鼠行為學(xué)、前額葉皮質(zhì)突觸相關(guān)蛋白谷氨酸受體(glutamate receptor1, GLUR1)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic Acid, NMDA)受體2B亞基(NR2B)表達的影響,進一步揭示電針產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性 WKY抑郁大鼠 45只,Wistar大鼠15只,體質(zhì)量(210±20)g,6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號 SCXK(京)2016-0006,購進后適應(yīng)性飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動物房內(nèi)1周,每籠3只,動物自由攝食環(huán)境,飼養(yǎng)室溫度(19～25)℃、濕度 53%～57%,自然晝夜節(jié)律。本實驗涉及方案經(jīng)中日友好醫(yī)院倫理委員會審查批準(No.zryhyy21-21-05-01),本實驗均依照中日友好醫(yī)院實驗動物管理準則和規(guī)定進行。

1.2 主要試劑與儀器

蔗糖(天津市北辰方正試劑廠);NR2B抗體(Ab65783, Abcam);GLUR1抗體(Ab174785, Abcam);山羊抗兔 IgG-HRP(111-035-003, Jackson Immuno-Research);山羊抗小鼠 IgG-HRP(115-035-003,Jackson ImmunoResearch);BCA蛋白定量試劑盒(#7780,CST);化學(xué)發(fā)光儀(WD-9423C,六一儀器);電泳儀(Powerpac Basic,美國伯樂 Bio-Rad);低溫冷凍離心機(Fresco17,美國熱電 Thermo Fisher);自制曠場實驗箱(80 cm×80 cm×40 cm);電針儀(華佗牌,規(guī)格SDZ-Ⅱ)。

1.3 分組與操作

將15只Wistar大鼠作為正常組,將45只WKY抑郁大鼠隨機分為電針組、假針組和模型組,每組15只。電針組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后,運用自制布袋進行束縛,僅將頭部露出布袋口,參照《實驗針灸學(xué)》[7]對腧穴進行定位,分別選取百會和印堂穴,選用規(guī)格為0.25 mm×25 mm毫針,百會穴向后頭部方向予以平刺,印堂穴向鼻尖方向予以平刺,針刺深度為 5～10 mm。針刺后連接華佗牌電針儀,正極與百會穴相連,負極與印堂穴相連,予以連續(xù)波頻率2 Hz,電流由0.1 mA開始逐漸加大,根據(jù)大鼠耐受程度,以頭部出現(xiàn)微微顫動而不掙扎、嘶叫為度,治療時間為每次 20 min,每日1次,共治療21 d。為避免不同人的針刺操作差異,針刺均由同一人完成。假針組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采取同樣的束縛方法予以固定,運用規(guī)格為0.25 mm×25 mm針灸針刺入大鼠百會和印堂穴的皮層,不刺入肌肉層,以防止非特異性針刺效應(yīng),刺入深度為 1～2 mm,將針灸針與電針儀導(dǎo)線相連,但不予以通電。留針時間、治療療程及其他注意事項均與電針組相同。正常組與模型組常規(guī)飼養(yǎng),不予干預(yù)。

1.4 指標檢測

1.4.1 大鼠體質(zhì)量

分別于實驗開始前1天、實驗結(jié)束后測量并記錄每只大鼠的體質(zhì)量,然后對各組大鼠體質(zhì)量的差異進行統(tǒng)計分析。

1.4.2 曠場實驗[8]

分別于實驗開始前1天、實驗結(jié)束后進行曠場實驗測評。保持實驗室周圍環(huán)境安靜。將每只大鼠放入曠場箱底面的中央方格內(nèi),由兩名實驗記錄者分別記錄大鼠在5 min內(nèi)的水平運動和垂直運動的頻次。以穿越曠場箱底面正方形塊數(shù)為水平穿越格數(shù),大鼠3只爪子穿越一格計為1分,得分為大鼠的水平穿越格數(shù);以大鼠兩前肢離開地面次數(shù)為垂直起立次數(shù),大鼠兩前爪騰空、亦或攀附曠場箱側(cè)壁方計為1分,得分為垂直起立次數(shù)。每只大鼠檢測1次,測試完后清除曠場箱內(nèi)的大鼠糞便及尿液,并用 75%醫(yī)用乙醇溶液進行清潔擦拭曠場箱底面,以避免上一只大鼠殘留的氣味影響下一只大鼠的實驗測評,待乙醇揮發(fā)完畢后繼續(xù)實驗。

1.4.3 糖水偏好實驗[9]

在實驗開始前 4天,訓(xùn)練所有大鼠適應(yīng)性飲用1%蔗糖水(蔗糖30 g,溶于實驗動物飲用水中,定容至 3 L),訓(xùn)練過程中皆雙瓶飼養(yǎng)。第 1天,兩瓶均裝1%蔗糖水;第2天,一瓶裝純凈水,一瓶裝1%蔗糖水;第 3天,實驗動物禁食禁水。禁食禁水 24 h后,在下午14:00—15:00,每籠同時予以提前稱好1瓶純凈水和1瓶1%蔗糖水,2 h后交換瓶子位置,4 h后取走兩瓶,分別進行稱重。糖水偏好指數(shù)＝[糖水消耗量/(糖水消耗量＋純水消耗量)]×100%。該實驗分別于實驗開始前和實驗結(jié)束后進行測試。

1.4.4 大鼠前額葉皮質(zhì)GLUR1、NR2B蛋白檢測

行為學(xué)實驗結(jié)束后第 2天,各組大鼠麻醉斷頭于冰上取前額葉皮質(zhì)并稱重,BCA法檢測蛋白濃度。制膠、制樣,電泳參數(shù)設(shè)置為恒壓80 V,20 min后轉(zhuǎn)為12O V,轉(zhuǎn)膜參數(shù)為恒流300 mA恒流,轉(zhuǎn)膜時間以目的蛋白分子大小而定。5%脫脂牛奶中封閉 60 min,加入一抗(NR2B濃度為1:2 000;GLUR1濃度為1:4 000)室溫孵育15 min,放4 ℃搖床過夜,TBST溶液洗膜3次,每次5 min,加入二抗(1:10 000),室溫輕搖 60 min,TBST溶液洗膜3次,ECL曝光成像并運用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS20.0進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且方差齊的要求,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較各組間的差異;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊,采用非參數(shù)檢驗進行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較

實驗前,同周齡 WKY抑郁大鼠體質(zhì)量明顯低于正常組大鼠,經(jīng)過21 d電針治療后,正常組大鼠體質(zhì)量增長明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);電針組大鼠的體質(zhì)量增長明顯高于假針組和模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。說明電針可增加抑郁大鼠攝食量,緩解體質(zhì)量減輕的癥狀。詳見表1。

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較 (±s, g)

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量比較 (±s, g)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與電針組比較2)P＜0.01

組別 n 實驗前 實驗后正常組 15 268.16±10.87 412.36±26.12電針組 15 237.74±8.331) 327.47±24.991)假針組 15 243.21±10.951) 282.89±17.031)2)模型組 15 242.98±11.771) 296.45±20.961)2)

2.2 各組大鼠實驗前后曠場實驗結(jié)果比較

實驗前與正常組大鼠比較,WKY抑郁大鼠水平穿越格數(shù)、垂直運動次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。實驗后與正常組大鼠比較,模型組大鼠水平穿越格數(shù)、垂直運動次數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與假針組和模型組比較,電針組大鼠水平穿越格數(shù)、垂直運動次數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。說明電針可以改善WKY抑郁模型大鼠的活動能力、探索行為及好奇程度。詳見表2。

表2 各組大鼠實驗前后水平穿越格數(shù)與垂直運動次數(shù)比較 (±s)

表2 各組大鼠實驗前后水平穿越格數(shù)與垂直運動次數(shù)比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與電針組比較2)P＜0.01

組別 時間 n 水平穿越格數(shù)(格) 垂直運動次數(shù)(次)正常組 實驗前 1 5 4 6.8 0±6.8 9 2 3.2 0±3.5 3實驗后 1 5 4 8.2 7±8.7 0 2 2.6 7±3.0 2電針組 實驗前 1 5 2 1.5 3±7.2 6 1) 5.3 3±2.5 6 1)實驗后 1 5 3 3.4 0±6.1 7 1) 1 3.4 7±2.6 3 1)假針組 實驗前 1 5 1 9.2 7±6.5 8 1) 6.6 7±2.0 9 1)實驗后 1 5 2 1.8 7±4.8 1 1)2) 6.2 7±2.0 7 1)2)模型組 實驗前 1 5 1 9.7 3±7.5 4 1) 5.7 3±2.3 7 1)實驗后 1 5 2 0.0 0±6.2 3 1)2) 5.8 7±2.1 7 1)2)

2.3 各組大大鼠實驗前后糖水偏好實驗驗測評結(jié)果比比較

實驗前與正常組比較較,WKY抑郁大鼠糖水消耗耗百分比明顯降低,差異有統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)意義(PP＜0.01),實驗驗后與正常組比較較,模型組大大鼠糖水消耗百百分比明顯降降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜00.01);與模型型組比較,電針針組糖水消耗百百分比明顯升升高,差異有統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)意義((P＜0.01);與假針組比較,電電針組大鼠糖水消耗百分比比增加,差異具有有統(tǒng)計學(xué)意義義(P＜0.01)。說明電針可改改善抑郁大鼠快感感缺失的癥狀狀。詳見表3。

表3 實驗前前后各組大鼠糖糖水消耗百分比比比較 (±s,%)

表3 實驗前前后各組大鼠糖糖水消耗百分比比比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)P＜0.011;與電針組比較較2)P＜0.01

組別n 實實驗前 實驗后正常組15 79.000±4.03 15 68.000±3.60 15 67.000±4.52 15 68.000±3.20 80.00±3.67電針組假針組模型組1)1)1)72.00±3.311)68.00±3.501)69.00±5.061)2)2)

2.4 各組大大鼠前額葉皮質(zhì) GLUR1、NR2B蛋白表達水水平比較

與正常組組比較,模型組大鼠GLUR1、NR2B蛋白表表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)意義(PP＜0.01);與模模型組比較,電針針組GLUR1、NNR2B表達水平平上調(diào)(P＜0..05,P＜0.01);與與假針組比較較,電針組GLURR1、NR2B表達達水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)學(xué)意義(P＜00.05);而模型型組GLUR1、NR2B蛋白表達水平變化無統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。詳見見表4。

圖1 各組大鼠干干預(yù)14天后前額額葉皮質(zhì)GLUR1、NRR2B蛋白條帶圖圖

表4 各組大鼠前前額葉皮質(zhì)GLURR1、NR2B表達達水平比較(±s)

表4 各組大鼠前前額葉皮質(zhì)GLURR1、NR2B表達達水平比較(±s)

注:與與正常組比較1)P＜0.05,2)PP＜0.01;與電針針組比較 3)P＜00.05,4)P＜0.01

組組別 n G L U R 1/β--a c t i n N R R 2 B/β-a c t i n正正常組 5 1.8 6±0 0.6 7 1.3 5±0.3 5電假模電針組 5假針組 5模型組 5 1.3 3±0 0.6 4±0 0.5 9±0 0.4 3 0 0.2 6 2)3) 0 0.2 4 2)3) 0.8 9±0.2 3 1).4 1±0.2 4 2)3).3 3±0.2 3 2)4)

3 討論

抑郁癥在中中醫(yī)學(xué)中屬于于“郁證”的范范疇,為狹義義之郁郁,即情志之郁郁,其病位主要要在腦,涉及心、肝、脾、腎等等臟腑。腦為元神之府,主主司人的思維、、意識和情志志活動動,腦神失用是是抑郁癥的主主要病機。百會會為督脈之穴穴位,位于巔頂,為為手足三陽經(jīng)經(jīng)、督脈與肝經(jīng)經(jīng)之交會穴,針灸灸百會可宣暢暢氣機、疏通經(jīng)經(jīng)脈、鼓舞陽陽氣以達宣陽開郁郁之效[10]。印堂堂穴雖為經(jīng)外外奇穴,但位于于督脈循行線線上,又為“上丹田田”,乃藏神之之所,具有醒神神調(diào)神、鎮(zhèn)靜靜安神神 之效[11]。百百會與印 堂配伍伍應(yīng)用 可宣陽陽開郁、通督督啟神神,兩穴為治療療抑郁癥的常常用穴位。

近年來,隨著著對抑郁癥的的研究不斷深入,諸多學(xué)者者越來來越意識到突突觸可塑性損傷傷在抑郁癥發(fā)發(fā)病中的重要要作用用。突觸可塑性性指突觸傳遞遞效能的可調(diào)節(jié)性,其有兩兩種表表現(xiàn)形式,分別為長長時程增強強(long-termm potentiation,LTP)、長時程抑制制(long-termm deppression, LTTD)。抑郁狀態(tài)態(tài)下常伴有LLTP和LTD的的改變變,前額葉錐體體細胞突觸可可塑性的LTP、、LTD改變尤尤為明明顯[12]。有研研究[13]表明抑郁郁癥發(fā)病與內(nèi)內(nèi)側(cè)前額葉皮皮層內(nèi)內(nèi)谷氨酸能系系統(tǒng)的激活有關(guān)關(guān)。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異 惡 唑唑 丙 酸 受 體體 (α-amino-3-hydroxy--5-mmethyl-4-isooxa-zoleproppionic acidd receptor,AMPPAR)是離子型型谷氨酸受體之之一,GLUR1作作為AMPAR的的一個個重要亞基,增增加其在突觸觸膜上的插入,可以使突觸觸傳遞遞效率增強,對對于突觸可塑塑 性和空間記記憶 的保留具具有重重要意義[14-15]。GLUR1在突觸觸可塑性LTPP的誘導(dǎo)過程程中扮扮演著十分重重要的角色,CCa2﹢濃度下降降后,鈣/鈣調(diào)調(diào)素依依賴蛋白激酶酶-Ⅱ(CaMKⅡ)依然具有較較長時間的活活性,可以作用于GGLUR1亞基的的磷酸化,調(diào)節(jié)節(jié)AMPAR受體體在突突觸后膜的移移動,增強AMPPAR單通道傳導(dǎo)作用。但是是在敲敲除了GLUR1基因的動物中中,盡管AMPARR的傳導(dǎo)作用依然存在,然而 LTP卻不能被誘導(dǎo)發(fā)生。因此,GLUR1在 Ca MKⅡ介導(dǎo)下對于誘導(dǎo) LTP的產(chǎn)生具有重要作用[16]。NMDA受體亦是離子型谷氨酸受體之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布,在突觸可塑性調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。其中,NR2B亞基作為NMDA受體的調(diào)節(jié)亞基與抑郁癥的發(fā)病關(guān)系密切[18-19]。NR2B主要分布于前額葉、海馬等前腦區(qū),與學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等緊密相關(guān)[20]。NR2B亞基表達不足或過度表達均可導(dǎo)致認知功能、情緒調(diào)節(jié)障礙,引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如抑郁癥。研究表明,NR2B亞基高水平表達能夠促使大量NMDA受體激活,進而使 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白得以激活,以產(chǎn)生更強、更穩(wěn)定的LTP,LTP的形成又能夠上調(diào)NR2B的表達水平,從而增強學(xué)習(xí)、記憶等功能[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),電針可明顯改善抑郁樣大鼠行為學(xué)癥狀,同時,電針治療可以在一定程度上調(diào)抑郁樣大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)GLUR1、NR2B蛋白表達水平,提示電針可能通過上調(diào)WKY大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)GLUR1、NR2B表達水平從而改善其突觸可塑性而發(fā)揮抗抑郁作用。

WKY大鼠是當(dāng)前運用較為廣泛的抑郁動物模型,ALEKSANDROVALR等[22]認為WKY大鼠在行為學(xué)方面表現(xiàn)為體質(zhì)量下降,曠場實驗中總運動量減少、中心運動時間減少,主動回避行為增加,蔗糖攝入量減少,強迫游泳實驗靜止時間增加,對新異物體識別能力降低,與臨床中抑郁患者快感缺乏、興趣降低、認知功能受損、求生欲下降的特點較為相符,且WKY作為內(nèi)源性抑郁模型,先天對應(yīng)激敏感,具有抑郁易感性,對臨床中常用的經(jīng)典抗抑郁藥,如氟西汀、文法拉辛、西酞普蘭、地帕西明、丙咪嗪等均產(chǎn)生耐藥,此模型有助于揭示新的抗抑郁靶點,即突觸可塑性在抑郁癥中發(fā)揮的作用。佘燕玲等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)電針可改善WKY大鼠抑郁樣行為和海馬超微結(jié)構(gòu)。也有研究[24-25]表明,電針對WKY大鼠抑郁樣癥狀有明顯改善,可提高海馬和僵核內(nèi)GLUR1蛋白表達量,為電針調(diào)節(jié)抑郁大鼠突觸可塑性提供了有效依據(jù)。

綜上,采用電針干預(yù) WKY抑郁大鼠可以較好地改善其抑郁樣癥狀,可能通過上調(diào)前額葉皮質(zhì) GLUR1、NR2B蛋白表達從而改善其突觸可塑性,來達到治療抑郁癥的目的。