具有DPP-Ⅳ抑制活性的酪蛋白糖肽分離純化及其序列鑒定

李琪琪，李天歌，焦穎澤，盧雪嬌，毛學英

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.河南農業大學食品科學技術學院，鄭州 450002）

0 引 言

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，該疾病已成為全球性公共衛生問題。目前2 型糖尿病發病率逐年增高，國際糖尿病聯盟調查顯示2021 年全球有5.37 億人患有糖尿病，預計到2045 年全球糖尿病患病人數將達到7.83 億。其中，2021 年中國的成人糖尿病患者數量高達1.4 億，位居世界第一位[1]。而2 型糖尿病是最常見的糖尿病類型，約占所有糖尿病病例的90%。2 型糖尿病以多種病理缺陷為特征，包括胰島素抵抗和進行性胰腺β細胞功能障礙，還會導致嚴重的并發癥如糖尿病足病、腎病、視網膜病變、心腦血管疾病等。因此，尋求預防和緩解2 型糖尿病的有效干預措施已引起越來越廣泛的關注。

目前2 型糖尿病的治療以西藥為主，主要包括磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-Ⅳ）抑制劑等[2]。DPP-Ⅳ抑制劑可與DPP-Ⅳ酶活性部位的205 位和206 位谷氨酸形成鹽橋[3]，從而降低DPP-Ⅳ酶的催化活性，提高胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性胰島素分泌多肽（glucosedependent insulinotropic peptide，GIP）等腸促胰島素的濃度，進而通過抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素、促進胰島β細胞分泌胰島素、改善胰島β細胞存活、再生和增殖等發揮降低血糖、保護胰島α細胞和β細胞功能等作用[4]。此外，由于腸促胰島素的釋放依賴于血液中的葡萄糖水平，在低于正常空腹血糖水平的狀態下，腸促胰島素水平并不會顯著升高，因此DPP-IV抑制劑可以有效減少低血糖的發生風險[5-7]。DPP-Ⅳ抑制劑的有效性已經經過了體外細胞實驗、動物實驗和臨床試驗的驗證。如Liu 等證明了在16.7 mmol/L葡萄糖和10 nmol/L GLP-1 作用下，DPP-IV 抑制劑維格列汀（100 nmol/L）使INS-1 832/13 細胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose stimulated insulin secretion ，GSIS）增加了22.0%[4]。Mu 等用DPP-IV 抑制劑去氟西格列汀治療胰島素分泌缺陷小鼠，可顯著增加離體胰島的胰島素含量，改善葡萄糖刺激的胰島素分泌[8]。在臨床環境中，DPP-IV 抑制劑阿格列汀單藥或與其他藥物聯合使用可以顯著改善2 型糖尿病患者的血糖控制[9]。但是臨床研究表明，這些化學合成的DPP-Ⅳ抑制劑會引起頭痛、眩暈、外周性水腫、肝功能異常等副作用[10]。因此，亟需尋找天然、無副作用的活性物質作為化學合成DPP-Ⅳ抑制劑的替代物。

生物活性肽因其安全性高、副作用低、生物活性多樣化而受到人們的關注[11-12]。天然食物蛋白經體外蛋白酶水解或體內消化道酶水解后，會產生許多具有生理作用的活性肽，對人體發揮多種生理調節作用[13]。其中，來源于牛乳酪蛋白、牛乳乳清蛋白、牦牛乳、駱駝乳等的水解物和活性肽已被證明具有良好的DPPIV 抑制活性[14-18]。根據文獻報道，DPP-IV 抑制肽具有一些共同特點：（1）疏水性氨基酸含量較高；（2）序列中有脯氨酸或丙氨酸，并且優先分布在N 端的第二位上，這是因為DPP-IV 能優先裂解氨基末端第二位上含有脯氨酸殘基或丙氨酸殘基的多肽。但是其兩側的氨基酸類型也會影響多肽對DPP-IV 的抑制活性；（3）氨基酸序列長度也會影響其活性，DPP-IV 抑制肽長度多為2-8 個氨基酸殘基[5-6,18-19]。牛乳酪蛋白糖巨肽是一種含有唾液酸的糖肽[20]，來源于κ-酪蛋白C-末端殘基106-169 區域，具有兩親性，富含疏水性的支鏈氨基酸（Leu、Val、Ile）。我們課題組前期研究發現酪蛋白糖巨肽酶解物及活性肽段在體內和體外能夠通過調控胰島素信號緩解胰島素抵抗，從而進一步改善2 型糖尿病的發生發展[21-23]。然而，關于酪蛋白糖巨肽酶解物的DPP-IV 抑制活性及其DPP-IV 抑制肽的分離鑒定尚待研究。

因此，本研究以牛乳酪蛋白糖巨肽為原料酶解制備牛乳酪蛋白糖巨肽酶解產物（即酪蛋白糖肽），以其DPP-IV 抑制活性為指標，篩選DPP-IV 抑制活性最高的酶解產物，并對其進行分離鑒定，旨在為功能性乳配料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳酪蛋白糖巨肽，丹麥Arla 公司；風味蛋白酶，丹麥諾維信公司。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、三氯乙酸（TCA）（分析純）、Tris 粉末（分析純），北京化工廠；DPP-Ⅳ、Gly-Pro-PNA，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

BS124S 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；JJ-1 精密定時自動攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FE28 pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SC-3612 低速離心機，安徽科大中佳；DRP-9082 電恒溫培養箱，上海森信；iMark 酶標儀，Bio-Rad Laboratories,Inc.；LGJ-72 冷凍干燥機，北京松源華興科技儀器有限公司；BSZ-100 自動收集器，蘇州江東精密儀器有限公司；HL-2S 恒流泵，上海嘉鵬科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計，日本島津有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛乳酪蛋白糖肽的制備

參考Li 等[24]的方法利用風味蛋白酶水解牛乳酪蛋白糖巨肽。具體為，稱取一定量的牛乳酪蛋白糖巨肽，按底物濃度5%（w/v）加水，在室溫下充分溶解。將溫度和pH 值調節至蛋白酶的最適溫度和最適pH值，按酶與底物的比例為5%（w/w）加入蛋白酶進行水解，水解在恒溫水浴鍋中進行，在水解過程中維持體系pH 不變。分別于水解后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5 h取樣，85 ℃滅酶20 min 終止反應，4 000 r/min 離心20 min 取上清液，凍干后待用。

1.3.2 牛乳酪蛋白糖肽DPP-Ⅳ抑制活性測定

參考Song 等[25]的方法。將凍干樣品用100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）配制成10 mg/mL 溶液。取20 μL樣品溶液和100 μL 底物Gly-Pro-pNA 溶液于96 孔板上，在37 ℃培養箱中孵育10 min，再加入30 μL DPP-Ⅳ溶液，在37 ℃孵育40 min，使酶標儀在405 nm處測定吸光值。同時設置空白對照組，陰性對照組以及陽性對照組。

1.3.3 牛乳酪蛋白糖肽水解度測定

參考Ma 等[26]的方法。吸取0.5 mL 已滅酶的樣品，冷卻后轉移至25 mL 容量瓶中，用質量濃度為10 mg/mL的十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液定容，靜置。取0.125 mL 酶解液的SDS 溶液與1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.2，0.2 mol/L）和1 mL 質量濃度為1 mg/mL 的三硝基苯磺酸溶液振蕩混合，于50 ℃避光水浴反應60 min，反應完畢后，用2 mL 0.1 mol/L HCl 溶液立即終止反應。室溫放置30 min 后，于波長420 nm 處測定其吸光度。利用0～5.0×10-3mol/L L-亮氨酸繪制標準曲線。

1.3.4 牛乳酪蛋白糖肽氨基酸組成測定

使用氨基酸分析儀測定牛乳酪蛋白糖肽的氨基酸組成[27]。樣品前處理方法：準確稱取10～20 mg 試樣于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L 鹽酸溶液和苯酚3～4 滴，放入冷凍劑中冷凍3～5 min，重復抽真空-充入氮氣3 次，在充氮氣狀態下封口，放在110±1 ℃的水解爐內水解22 h，冷卻至室溫，將水解液定容至50 mL。準確吸取1.0 mL 濾液移入15 mL 試管內，在40～50 ℃加熱環境下減壓蒸干。用1.0～2.0 mL pH 2.2 檸檬酸鈉緩沖溶液溶解樣品，過0.22 μm 濾膜上樣。

1.3.5 牛乳酪蛋白糖肽不同組分的分離

參考Harnedy 等[28]的方法，采用G-25 凝膠過濾層析對酪蛋白糖肽進行分離。具體為，將溶脹好的Sephadex G-25 介質填充到層析柱中，用去離子水進行平衡。酪蛋白糖肽溶液經0.22 μm 濾膜除去雜質，樣品進樣量為1 mL，洗脫劑為去離子水，洗脫流速為1 mL/min，在220 nm 波長下進行檢測。收集各洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.6 牛乳酪蛋白糖肽的純化及氨基酸序列鑒定

通過RP-HPLC 對酪蛋白糖肽DPP-IV 抑制活性較高組分進行純化，得到不同保留時間的樣品，測定其DPP-IV 抑制活性，再利用LC-ESI-MS/MS 對DPPIV 抑制活性最強的分離組分進行分析，鑒定具有DPP-IV 抑制活性的牛乳酪蛋白糖肽的氨基酸序列。

RP-HPLC 條件：色譜柱：C18 柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈，流動相B：超純水；流量：0.5 mL/min；進樣量：5 μL；檢測波長：220 nm。

1.4 數據處理

試驗至少重復3 次，取其平均值，結果以平均值±標準偏差（x ± SD）表示。采用SPSS 19.0 軟件對數據進行分析，當P＜0.05 時認為具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白糖巨肽酶解產物（酪蛋白糖肽）對DPP-Ⅳ的抑制作用

酪蛋白糖巨肽不同酶解時間酶解產物的水解度及其DPP-Ⅳ抑制率如圖1 所示。由圖1 可知，隨著水解時間的延長，酪蛋白糖巨肽酶解產物的水解度呈上升趨勢，在前30 min 水解時間內變化最為明顯，水解60 min 時酶解產物的水解度上升至17.41±0.80%。此后水解度的增長較緩慢，水解5 h 后，酶解產物的水解度達到23.10±0.42%。Gao 等的實驗結果也展現出類似的趨勢，從0 h 到3 h，水解度隨水解時間的延長而增加，且在水解前30 min 水解度的變化幅度最大[29]。此外，為了篩選DPP-IV 抑制活性最高的酶解產物，測定了不同酶解時間酶解產物的DPP-Ⅳ抑制活性，如圖1 所示，相比于其他時間點的酶解產物，45 min時獲得的酶解產物對DPP-Ⅳ活性的抑制率最高，為54.55±3.65%。該結果的出現可能是因為隨著酶解時間的延長，酶解45 min 時產生的DPP-IV 抑制肽進一步被降解為更短的肽段或氨基酸而降低或失去了活性；與此同時，在后續的酶解過程中可能又產生了新的活性肽段。因此，該結果說明在本研究的水解條件下酶解時間為45 min 時水解物中含有更多具有DPP-IV 抑制活性的肽段或者此時酶解物中的肽段DPP-IV 抑制活性最強。已有報道也發現DPP-IV 抑制活性的最高點均出現在酶解過程中的某個時間點而非酶解時間最長的樣品[29-31]。因此，本研究選擇水解45 min 時獲得的酶解產物進行后續實驗。

圖1 酶解時間對酪蛋白糖巨肽酶解產物水解度及DPP-Ⅳ抑制率的影響

2.2 具有DPP-Ⅳ抑制活性的酪蛋白糖肽的氨基酸組成

具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖巨肽酶解產物（命名為酪蛋白糖肽）的氨基酸組成如表1 所示。從表中可以看出，酪蛋白糖肽的谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、異亮氨酸（Ile）的含量較高，分別為14.14%、11.53%、7.78%、7.62%。相比于酪蛋白糖巨肽，酪蛋白糖肽的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）含量明顯提高。文獻報道表明，具有較高含量的Ile 和Pro 等疏水性氨基酸是DPP-IV 抑制肽的共同特征之一[19]。

表1 酪蛋白糖巨肽及其具有DPP-Ⅳ抑制活性酶解產物的氨基酸組成

2.3 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的分離純化

利用G-25 葡聚糖凝膠柱分離具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽，樣品吸光值如圖2（a）所示，測定分離組分26～42 號（F1 組分）和43～61 號（F2 組分）的DPP-Ⅳ抑制率，結果如圖2（b）所示，相比于未經凝膠柱分離的樣品和F2 組分，F1 組分的DPP-Ⅳ抑制率明顯提高，達到63.27±3.24% 。因此選用F1 組分進行進一步實驗。據報道，活性肽的氨基酸序列長度會影響其DPP-IV 抑制活性[19]，在F1 組分中含量可能較高，而F2組分后于F1 組分流出，其中可能含有游離氨基酸。

圖2 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的G-25分離組分及其DPP-Ⅳ抑制率

采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對F1 組分進行進一步分離。F1 組分經RP-HPLC 分離后得到的色譜圖，如圖3 所示。分離得到2 個峰，保留時間分別為3.33 min 和4.35 min。

圖3 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽分離組分F1 的RP-HPLC 色譜圖

2.4 具有DPP-Ⅳ抑制活性分離組分F1 的氨基酸序列

采用LC-ESI-MS/MS 對反向高效液相色譜分離組分F1 進行氨基酸序列鑒定，通過一級和二級質譜分析，并結合數據庫進行比對及與其他文獻比較，得到了可能具有DPP-IV 抑制活性的肽段，序列信息見表2。活性肽段二級質譜圖如圖4 所示，質荷比為685.88 的雙電荷離子的LC-MS/MS 譜圖與序列MAIPPKKNQDKT 匹配，質荷比為402.98 的四電荷離子的LC-MS/MS 譜圖與序列PPKKNQDKTEIPTI匹配，質荷比為655.83 的雙電荷離子的LC-MS/MS譜圖與序列SPEVIESPPEIN 匹配。這3 條肽段都含有Ala、Pro，且Pro 含量較高，而Pro 已被報道與DPP-Ⅳ抑制活性有關。

表2 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的活性肽段信息

3 結 論

本研究收集不同時間的酶解產物，通過測定酪蛋白糖巨肽酶解產物的DPP-IV 抑制率，篩選出DPPIV 抑制活性最高的酶解物（酪蛋白糖肽），抑制率為54.55±3.65%，酪蛋白糖肽中Glu、Thr、Pro、Ile 氨基酸含量較高。具有DPP-IV 抑制活性的酪蛋白糖肽經Sephadex G-25 分離獲得兩個組分，其中F1 組分具有較強的DPP-IV 抑制活性，抑制率為63.27±3.24%。采用RP-HPLC 對F1 組分進一步分離并通過LC-ESIMS/MS 進行氨基酸序列鑒定，得到DPP-Ⅳ抑制肽MAIPPKKNQDKT、PPKKNQDKTEIPTI、SPEVIESPPE IN。本研究主要對酪蛋白糖肽的DPP-IV 抑制活性進行了體外評價，后續將采用動物實驗進一步驗證。

由于糖尿病的發病率逐年增加及人們對健康需求的不斷提高，天然食物蛋白源DPP-Ⅳ抑制肽類降血糖功能食品的研發逐漸受到關注與重視。本研究明確了酪蛋白糖巨肽酶解產物的DPP-Ⅳ抑制活性，并對其中的DPP-Ⅳ抑制肽進行了分離和鑒定，為酪蛋白糖肽在降糖功能食品的開發應用提供了科學依據。