富硒乳酸菌的篩選及富硒發酵乳抗氧化活性研究

李理，朱珺，林國棟，陳蘇，陳麗娥，陳作國

（杭州娃哈哈集團有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州 310018）

0 引 言

硒是人體必需的14 種微量元素之一，動物和人體內不能合成，必須通過飲食獲得。1957 年首次認識到硒對營養性肝壞死的保護作用后[1]，其抗氧化、抗癌、保護心臟、提高機體免疫力、防治近視以及白內障、解毒、延緩衰老、增強生殖功能等多種生物活性和藥理作用被相繼報道，被譽為“生命火種”、“心臟的守護神”和“抗癌之王”[2-3]。我國約2/3 的地區近7 億人口處于缺硒的狀態[4]。與我國硒攝取的實際狀況相結合，1988 年中國營養家學會將微量元素硒列入我們每日必須攝入的15 種膳食營養素之中。為了保證人體日均生理補硒的安全性，我國對富硒食品中硒的限量也有嚴格的要求，《食品安全國家標準-食品營養強化劑使用標準》GB14880-2012 中對大米、小麥粉、面包、餅干、含乳飲料中硒的使用量進行了限制，其中含乳飲料中硒的使用量為50～200 μg/kg。

大量研究表明，硒元素在人體內的吸收、代謝以及生物功效的發揮，與其形態有著緊密的聯系[5]。一般而言，無機硒的水溶性高，毒性最大，生物利用率低；有機硒毒性較無機硒小，可以與功能性大分子物質的結合，能夠在抗氧化、抗腫瘤等生物活性方面產生協同效應，且生物利用率高，能夠滿足人體多樣化的營養需求[6]；納米硒毒性最小，易于被人體吸收且能夠發揮無機硒和有機硒所共有的功能性質[7]。目前硒的富集方法主要有植物富集法、動物富集法和微生物富集法[4]。采用微生物轉化富集到的有機硒與天然食物的有機硒的組成相似，如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等，既可提高硒的生理活性，又可降低其毒性，有利于機體吸收[6，8]。

近年來，許多研究報道了乳酸菌可以將無機硒轉化成有機硒[9-11]。考慮到有機硒和乳酸菌均具有一定的生物活性，對人體健康和人體營養需求的重要作用，在飲食中添加硒，尤其是富硒的發酵食品和含硒的膳食補充劑，已經受到廣泛重視和認可。本研究以32 株乳酸菌為材料，通過檢測對亞硒酸鈉的耐受性和轉化能力來篩選富硒性能優良的菌株，再通過優化菌株發酵性能、亞硒酸鈉添加量、亞硒酸鈉添加方式等，確定富硒發酵乳的最佳制備工藝，最后檢測抗氧化活性的相關指標，評價富硒發酵乳的抗氧化活性，以期為富硒發酵食品的開發提供原料和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 株乳酸菌，由浙江省食品生物工程重點實驗室自主分離得到，其中菌株4030、4394、4187 分離自貴州發酵蔬菜，菌株4115 分離自貴州米酒，菌株4246、4446 分離自貴州腌肉糟，菌株823 分離自內蒙古發酵酸牛奶，菌株815、918 分離自青海發酵酸牛奶，菌株1577、1602、1774、1818、1610 分離自西藏傳統發酵酸牛奶、菌株1800 分離自西藏青稞酒曲、菌株1636、1595、3888 分離自西藏乳扇，菌株1626、1643 分離自西藏酥油，菌株3471 分離自新疆發酵酸馬奶，菌株2538、3708、2518、3816、3824 分離自新疆發酵酸牛奶，菌株3788、3828、3832 分離自新疆奶疙瘩，菌株3379分離自新疆酥油；MRS 肉湯、技術瓊脂粉，廣東環凱微生物科技有限公司；M17 肉湯，青島海博生物技術有限公司；脫脂乳粉，恒天然（中國）有限公司；細菌/細胞總DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；亞硒酸鈉，Sigma 生物試劑有限公司；1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（DPPH），上海麥克林生化試劑有限公司；過氧化氫、甘油、氯化鈉、硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、鐵氰化鉀、亮綠、硫酸亞鐵、無水乙醇，均為國產分析純試劑。

SG604 生物安全柜，美國Baker 公司；OptimaTMXPN 超速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；DNP-111 電熱恒溫培養箱，上海海向儀器的設備廠；DU800 紫外分光光度計，美國Beckman 公司；AFS9330 原子熒光光譜儀（配硒空心陰極燈），北京吉天儀器有限公司；分析天平、Delta320pH 計，瑞士梅特勒-托利多有限公司；MSH-R-O3P 數顯加熱型磁力攪拌器，澳大利亞KEWLAB 公司；HH-US 恒溫水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司；7000 PCR 擴增儀，美國Applied Bio Systems 公司；KQ-300GVDV 雙頻恒溫超聲清洗破碎儀，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化、鑒定和保藏

采用平板劃線法分離純化，得到的單菌落轉接至液體培養基中擴大培養，菌液進行革蘭氏染色、鏡檢和H2O2酶試驗，初步鑒定為乳酸菌后，再進行16S rDNA測序鑒定。

取適量菌株純化后的培養物，離心棄上清后用細菌/細胞總DNA 試劑盒提取DNA，選擇乳酸菌通用引物27F 和1492R 對菌株的16S rDNA 片段進行擴增。PCR 產物寄送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序結果進行BLAST 比對，確定菌株種屬。經鑒定后的菌株純培養物連續傳代2 次后，獲得的菌液加甘油作為保護劑，-80 ℃保存。

1.2.2 菌株活化

將甘油管中保存的菌液在無菌條件下分別接種至MRS/M17 液體培養基中，37 ℃培養12～24 h，活化2～3 代后即可供菌株篩選使用。

1.2.3 富硒乳酸菌的篩選

將活化的菌液按3%比例接種至含有亞硒酸鈉（15 mg/L）的MRS/M17 液體培養基中，37 ℃培養至大約對數生長期（10～12 h），分光光度計測600 nm 處的吸光值，3 次平行試驗。取10 mL 培養至對數期的菌液，12 000 rpm 離心10 min 后，上清液過0.22 μm 針頭式水系濾膜以完全除去菌體。按《食品安全國家標準 食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法分別檢測培養基中和菌上清中的總硒含量，根據檢測結果，計算各菌株的硒轉化率。

硒轉化率=（培養基中硒含量-上清中硒含量）/培養基中硒含量×100%

1.2.4 富硒乳酸菌發酵性能評價

將篩選得到的富硒性能較優的菌株按接種量為3×106CFU/mL 分別接種至10%脫脂乳+3%蔗糖中，40 ℃培養12 h，每隔1 h 測定pH 值，3 次平行試驗。以培養時間為橫坐標，以pH 值為縱坐標，繪制生產酸曲線。發酵結束后，取終點樣品測定發酵乳中乙醛、雙乙酰含量，并進行感官評價。其中乙醛和雙乙酰含量測定方法參考文獻[12]，感官評價方法參考文獻[13]。

1.2.5 適宜亞硒酸鈉濃度的確定

根據《食品安全國家標準-食品營養強化劑使用標準》GB14880-2012 中對乳飲料中硒含量的要求，分別配置含亞硒酸鈉質量濃度為50、75、100、125、150、200 μg/L 的發酵基料，菌株按3×106CFU/mL 接種至發酵基料中，40 ℃培養至pH 值接近4.6，觀察發酵乳顏色，同時測定硒轉化率，確定最適加硒量。

1.2.6 發酵乳中硒含量的測定

發酵乳中總硒含量測定采用《食品安全國家標準食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法進行。發酵乳中無機硒含量檢測如下：準確移取試樣30.00 mL（精確到0.01 mL）于100 mL 小燒杯中，加熱濃縮值5 mL 以下，轉移至10 mL 離心管中，純水定容值10 mL，渦旋混勻，超聲10 min 后，于80～90 ℃水浴振蕩提取1 h，其間每隔20 min 取出上下顛倒，使樣品充分混勻，水浴結束后，再使用超聲提取20 min。提取完畢，冷卻至室溫，以8 000 rpm 離心15 min。取上層清液，用NaOH 溶液（5 g/L）調節pH值至4～7后，經0.22 μm 針頭式有機過濾膜過濾，濾液采用GB5009.93-2017 中第一法進行硒含量檢測。

1.2.7 富硒發酵乳的制備

準確稱取100.0 g 脫脂乳粉、30.0 g 白砂糖、870.0 g飲用水混合均勻，預熱至70 ℃、20 MPa 均質，105 ℃殺菌10 min，冷卻至40 ℃左右。優選菌株按3×106CFU/mL的量接種至含有亞硒酸鈉的發酵基料中，40 ℃發酵至pH 值4.6 左右，破乳終止發酵，冷卻至10 ℃，無菌分裝，得到富硒發酵乳。

1.2.8 富硒發酵乳抗氧化活性的測定

按1.2.7 所述制備富硒發酵乳，同時制備原料乳中不添加亞硒酸鈉發酵的無硒發酵乳和原料乳中添加亞硒酸鈉，但不經菌株發酵的無機硒乳，參考許牡丹等人[14]方法，并作適當改進，比較3 種乳樣品的抗氧化活性。

1.2.8.1 羥自由基清除能力測定

取1.0 mL 1,10-鄰菲羅啉溶液（6 mmol/L）與2.0 mL PBS 溶液混合，再加入1.0 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L），立即混勻。準確加入1.0 mL 乳樣品后加入1.0 mL 過氧化氫溶液（0.1%）和無菌水，反應總體積為8.0 mL。混合好的溶液37 ℃孵育1 h 后，于536 nm 處測定吸光值。羥自由基清除率=（As-Ac）/（Ab-Ac）×100%，式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS、硫酸亞鐵和過氧化氫）；Ab為空白組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS 和硫酸亞鐵）。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力測定

用無水乙醇配置0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。1 mL DPPH 乙醇溶液與1 mL 乳樣品充分混勻，避光室溫反應30 min，于517 nm 處測定吸光值，記為As，以等體積無水乙醇替換DPPH 溶液測量吸光值，記為Ab，以等體積蒸餾水替換樣品測量吸光值，記為Ac。

DPPH 自由基清除率= [1-（As-Ab）/Ac] ×100%

1.2.8.3 超氧陰離子自由基清除率

取0.1 mL 乳樣品于4.5 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液（50 mmol/L，pH=8.0）混合，25 ℃水浴20 min 后，加入0.4 mL 鄰苯三酚溶液（以HCl 為溶劑配置成25 mmol/L），25 ℃水浴反應5 min，立即用2 滴HCl 溶液（8 mmol/L）終止反應，于325 nm 處測吸光值，記為As，用無菌水調零，無菌水代替樣品測得的吸光值，記為A0。

超氧陰離子自由基清除率=（A0-As）/ A0×100%

1.2.9 統計分析

測定指標均表示為3 次平行試驗的平均值±標準偏差。顯著性分析采用SPSS 17.0 軟件中的Duncan’s多重比較檢驗法進行分析，顯著水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的16S 鑒定結果

將分離得到的32 株菌的測序結果在GenBank 的BLAST 數據庫中比對核苷酸序列的同源性，同源性在98%以上認為是同一種屬。鑒定結果如表1 所示，32 株菌均為乳酸菌。

表1 菌株16S rDNA 鑒定結果

2.2 富硒菌株的篩選

32 株乳酸菌在亞硒酸鈉添加量為15 mg/L 的MRS/M17 液體培養基上菌體生長情況如圖1 所示。由圖1 可知，與未加硒培養的對照組相比，菌株1577、1818、1643、2518、3816、3824、3832、4030、4115、3728、1800、3471 的生長明顯受到抑制，OD 值下降顯著（P＜0.05），菌株1602、1774、981、1595、1626、3473、4187 的生長抑制更加明顯，OD 值下降極顯著（P＜0.01），其余13 株菌的OD 值變化不明顯，說明在添加15 mg/L 的亞硒酸鈉后菌株的生長沒有受到明顯的影響，具有良好的硒耐受性，本研究中菌株硒耐受性的測試結果與韋夢婷等人[11]的研究結果相似。

圖1 菌株硒耐受性篩選

對硒耐受性良好的菌株培養液上清中的硒含量進行測定，并計算各菌株的富硒率，結果如表2 所示。由表可知，在含15 mg/L 的亞硒酸鈉的培養基中菌株的富硒性能差別明顯，菌株1610 的富硒率最高為81.1%，菌株3888、815、3379 的富硒率在70.00%～80.00%，菌株823、1636、2538、3708、4246 的富硒率在60.00%～70.00%，菌 株4394、4446、3788、3828 的 富 硒 率 在50.00%以下，其中菌株3828 的富硒率最低為27.87%。韋夢婷等人[11]的研究中指出，經過優化后部分乳酸菌菌株的富硒率提高至70%以上，且菌株的富硒率最高可達到81.80%，與本文研究篩選結果較為一致，因此我們篩選富硒率70%以上的菌株，分別為菌株1610、3888、815、3379 進行發酵性能的評價，以便獲得兼具優良富硒性能和發酵性能的菌株。

表2 耐受菌株的硒富集情況

2.3 富硒菌株的發酵性能

菌株的產酸速率、后酸穩定性以及產生乙醛、雙乙酰的量是評價其發酵性能的重要指標。由圖2 可知，菌株3888 和3379 的產酸速率適中，但pH 值達到4.5 左右后繼續深度發酵，至發酵終點時，pH 值分別下降至3.49 和3.70；菌株815 的產酸延遲期較長，從4.5 h 左右才開始產酸，pH 值到達4.5 之后的發酵程度也比較深，到終點時pH 值低至3.68；菌株1610 整體的產酸速率適中，發酵5 h 后pH 值達到4.52，之后緩慢產酸至發酵終點，pH 值為4.20，后酸比較平穩。

圖2 富硒菌株發酵乳產酸曲線

由表3 結果可知，以單菌株發酵獲得發酵乳中乙醛和雙乙酰的含量各有不同，結合風味評價描述發現，當乙醛含量較高時，發酵乳呈現典型發酵乳香氣，當雙乙酰含量較高時，發酵乳的乳脂風味突出。菌株815 的乙醛產量最高，但雙乙酰含量較低，因此缺乏乳脂香氣；菌株1610 的雙乙酰產量最高，呈現出濃郁的乳脂風味。一般認為，乙醛由保加利亞乳桿菌發酵產生，雙乙酰由嗜熱鏈球菌產生，且當酸奶中乙醛含量較低時，雙乙酰占主導地位，形成具有獨特奶香味的發酵乳[15-16]，本研究中的菌株1610 為一株嗜熱鏈球菌，菌株815 為一株德氏乳桿菌保加利亞亞種，其發酵產生的特征風味物質以及呈現出的風味符合這一特點。

綜合分析各菌株產酸特性和特征風味物質含量發現，菌株3379 的產酸速率較慢，且風味欠佳，不適合酸奶發酵，其余3 株發酵性能良好，其中菌株1610的產酸速率適中，后酸化穩定，且能夠形成較高含量的乙醛和雙乙酰，呈現出乳脂香氣濃郁的發酵乳風味，發酵性能最優。

2.4 不同濃度亞硒酸鈉對發酵乳感官品質和硒轉化的影響

有研究指出，亞硒酸鈉的濃度會對發酵乳的品質，如顏色、味道產生影響，也會影響菌株對硒的轉化[17]。乳酸菌自身在亞硒酸鈉環境中具有解毒作用，可將富集的硒一部分轉化成有機硒，而另外一部分可以被還原成零價態的單質硒，單質硒在溶液中呈紅色[7]。本研究中，不同濃度亞硒酸鈉對發酵乳的顏色和味道影響不明顯，添加量為最高200 μg/L 時，發酵乳均呈現乳白色，顏色沒有變化，也沒有金屬味道產生，說明實驗中各濃度的亞硒酸鈉沒有對菌株形成毒性，硒的轉化為生理性富集，絕大部分以有機硒形式存在。另一方面，不同濃度的亞硒酸鈉對發酵過程硒轉化率影響較大，且各菌株的變化趨勢較為一致，如圖3 所示。當濃度為50 μg/L 時，轉化率較低，隨后逐漸升高，當濃度增加至125 μg/L 以后，轉化率趨于穩定。其中菌株3888 整體硒轉化水平較低，原因可能是由于該菌的產酸速率較快，發酵時間比另外兩株菌少0.75 h 造成的，Alzate 等人[18]的研究中也發現了相似的結果，乳酸菌發酵12 h 時，硒轉化率為89±1%，發酵24 h 時增加至94±1%。綜合考慮法規要求、硒轉化率和有機硒生成量，確定150 μg/L 為亞硒酸鈉的最優濃度。

圖3 不同濃度亞硒酸鈉對發酵乳中菌株硒轉化的影響

2.5 富硒發酵乳抗氧化活性的研究

2.5.1 羥自由基清除能力

羥自由基能夠降解DNA、損傷細胞膜和多糖化合物，是導致脂質過氧化和人體細胞損傷的最主要的自由基之一。在本研究中,如圖4 所示，3 種乳樣品都有一定的羥自由基清除能力，其中富硒發酵乳的清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發酵乳（P＜0.05）。3 株乳酸菌相比，菌株1610 制備的富硒發酵乳清除能力最強，清除率為45.69±3.61%，分別是無機硒乳和無機硒發酵乳的2.99 倍和2.49 倍，分析原因可能是由于菌株1610 在乳中的硒轉化率較高，發酵乳中有更多的有機硒產生。Penas 等人[19]在制作德國泡菜時，在發酵前加入0.3 mg 亞硒酸鈉，發酵后發現泡菜的抗氧化活性因為有機硒的生產而顯著提高，為對照組的1.75 倍。

圖4 富硒發酵乳羥自由基清除能力

2.5.2 DPPH 自由基清除能力

清除DPPH 自由基能力被廣泛應用于抗氧化能力評價中，本研究中如圖5 所示，經過乳酸菌富硒的發酵乳的DPPH 自由基清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發酵乳的DPPH 自由基清除率為1610（47.15±3.20%）＞815（34.64±1.44%）＞3888（30.90±2.97%）。發酵乳通常具有一定抗氧化活性，但一般活性較低，乳酸菌是有機硒的良好載體，在乳原料中添加適量無機硒，經過特定菌株發酵轉化后，使得發酵乳的抗氧化活性顯著提高，形成協同效果。

圖5 富硒發酵乳DPPH 自由基清除能力

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是生物體代謝過程中產生的一種自由基，多種乳酸菌被報道過其發酵液、菌上清和菌體均有超氧陰離子自由基清除的能力[20]。本研究發現，富硒后的發酵乳超氧陰離子的清除能力最強，顯著高于無機硒乳和無硒發酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發酵乳的超氧陰離子自由基清除能力為1610（70.20±3.32%）＞3888（64.35±3.35%）＞3888（60.72±4.18%）。超氧陰離子的清除主要通過超氧化物歧化酶進行，有研究報道，采用含有機硒的飼料飼喂仔兔后，兔血清中的SOD 酶顯著升高，說明有機硒可以促進SOD 酶的生產，從而提高超氧陰離子的清除能力[21]。本研究中富硒發酵乳超氧陰離子清除能力的增強可能也是通過有機硒的生成，從而促進了SOD 酶的活性。

圖6 富硒發酵乳超氧陰離子自由基清除能力

3 結 論

本研究從32 株乳酸菌中篩選得到了3 株硒轉化能力強且發酵性能優良的菌株，分別是嗜熱鏈球菌1610、乳酸乳球菌3888 和得到乳桿菌乳亞種815。當培養基中添加15 mg/L 的亞硒酸鈉時，1610 的富硒率為81.11±2.07%，3888 的富硒率為78.47±3.10%，815的富硒率為71.20±3.47%。以3 種菌株為發酵菌種制備富硒發酵乳，亞硒酸鈉最適添加量為150 μg/L，富硒率最高可達到88.39±10.61%，且發酵乳顏色呈現乳白色和典型發酵乳香氣，沒有紅色和金屬味，感官品質良好。與無機硒乳和無硒發酵乳相比，3 株菌制備的富硒發酵乳的羥自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著升高，說明經過含有有機硒的發酵乳具有更好的抗氧化活性。

乳酸菌是有機硒良好的載體，利用特定乳酸菌菌株能夠將無機硒轉化成有機硒的特性，賦予發酵乳雙重的功能特性，具有良好的市場空間。本研究發現篩選獲得的富硒菌株可在發酵乳時對無機硒進行快速高效的轉化，當底物濃度合適時，絕大部分以有機硒形態存在，且顯著提高了發酵乳的抗氧化活性。后期研究將進一步分析發酵乳中有機硒的形態以及有機硒與抗氧化活性之間的聯系，為富硒功能性發酵乳制品的開發提供支撐。