安五脂素對(duì)D-gal致衰老小鼠胸腺的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制①

李 欣 孫靖輝 王春梅 陳建光 敬 舒 李 賀 （北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 132013）

衰老是生物體不可避免的自發(fā)現(xiàn)象，伴有組織和器官的逐漸退化。隨著全球人口老齡化程度日趨增加，對(duì)抗衰老藥物及保健食品的研究已成為熱點(diǎn)［1］。關(guān)于衰老發(fā)生的機(jī)制，二十世紀(jì)六十年代，HARMAN 提出了自由基衰老學(xué)說(shuō)，他認(rèn)為當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基后，會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞和組織造成持續(xù)傷害，導(dǎo)致機(jī)體的衰老［2］。同期，美國(guó)病理學(xué)家WOLFORD［3-4］首次提出了免疫衰老的學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為機(jī)體的衰老是由機(jī)體免疫功能的衰退導(dǎo)致的，即免疫系統(tǒng)從根本上決定了機(jī)體的衰老。在衰老動(dòng)物模型方面，有研究表明，D-gal 誘導(dǎo)的衰老動(dòng)物和自然衰老動(dòng)物具有較多的相似特征，已被廣泛應(yīng)用于抗衰老相關(guān)藥物的研究［5-7］。胸腺作為機(jī)體內(nèi)重要的中樞免疫器官，其功能狀態(tài)對(duì)機(jī)體的免疫功能有直接的影響，而D-gal 會(huì)使胸腺發(fā)生退行性變化，出現(xiàn)胸腺組織萎縮，功能減弱，免疫功能衰退，進(jìn)而導(dǎo)致免疫衰老［8-11］。

傳統(tǒng)中藥華中五味子（schisandra sphenanthera rehd.et Wils）已作為可用于保健食品的中藥，在抗氧化、保護(hù)肝臟損傷等方面具有諸多研究和應(yīng)用［12-16］。安五脂素是華中五味子木脂素標(biāo)志性單體化合物成分，然而，目前關(guān)于其功效的研究較少［17-19］。前期研究發(fā)現(xiàn)安五脂素對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的衰老小鼠肝臟組織、腦組織和脾臟組織具有顯著的保護(hù)作用，有很強(qiáng)的抗衰老作用，但其對(duì)胸腺組織的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道［20-22］。因此，本研究旨在明確安五脂素對(duì)衰老小鼠胸腺組織的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為研究和開(kāi)發(fā)抗衰老及改善免疫功能的藥物和保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，6~8 周齡，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（吉）：2017-0005。

1.1.2 試劑 安五脂素購(gòu)自四川省成都普菲德生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）購(gòu)自山東濰坊力特復(fù)合材料有限公司；D-gal 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；IL-2 試劑盒和 IFN-γ 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司；SOD試劑盒和MDA 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ECL 顯色液購(gòu)自碧云天生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 將80 只健康ICR小鼠隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組（灌胃羧甲基纖維素鈉，生理鹽水皮下注射，10 ml/kg），模型組（灌胃羧甲基纖維素鈉，220 mg/kg D-gal 皮下注射，10 ml/kg）和安五脂素低、中、高劑量組（分別灌胃1、2和4 mg/kg安五脂素，并皮下注射 220 mg/kg D-gal，10 ml/kg），每組16 只，灌胃和皮下注射1 次/d，持續(xù)給藥42 d。每天觀察并記錄各組小鼠的身體狀況，每隔3 d 稱(chēng)1次體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 安五脂素對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響 1.2.1所述的每組小鼠連續(xù)給藥，42 d后稱(chēng)取體質(zhì)量，在末次給藥后30 min 后處死小鼠，取出胸腺組織，去除周?chē)M織，經(jīng)生理鹽水洗滌后用濾紙吸干，稱(chēng)取胸腺組織重量并計(jì)算胸腺指數(shù)，根據(jù)以下公式：胸腺指數(shù)（%）=胸腺重量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.3 安五脂素對(duì)小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影響 1.2.1 所述的每組小鼠連續(xù)灌胃42 d，末次給藥后30 min 后，取外周血標(biāo)本，3 500 r/min 離心10 min，收集上清，通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 的含量。具體方法參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織病理學(xué)的影響按1.2.1所述的每組小鼠隨機(jī)選取3只，同1.2.2方法取出胸腺組織，將其置于10%的中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切成5~10 μm厚的切片。切片進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.2.5 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中SOD 活力和MDA 含量的影響 按照1.2.2 所述方法分離出小鼠胸腺組織，將其用生理鹽水制為10%的胸腺勻漿。通過(guò)WST-1（水溶性四氮唑）法檢測(cè)SOD 活性，通過(guò)TBA（硫代巴比妥酸）法檢測(cè)MDA 含量，具體方法參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 及 Bax 蛋白表達(dá)的影響 每組小鼠末次給藥30 min 后，按照1.2.2 所述方法分離出小鼠胸腺組織，按比例加入裂解液，冰上裂解1 h，高速離心（10 min，12 000 r/min），吸取上清液，測(cè)定胸腺組織蛋白濃度，以10%電泳凝膠電泳分離Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 和 Bax 蛋白。電轉(zhuǎn)移 2 h至聚丙二氟乙烯膜，Tris 緩沖液（TBS-T）漂洗5 min，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入一抗 Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、Caspeas3（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000），4 ℃溫育過(guò)夜后，TBS-T洗5 次×5 min。加入二抗（1∶5 000）溫育 2 h，TBS-T 洗5次×5 min，最后加入顯色液ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠胸腺指數(shù)，血清中IL-2 和IFN-γ 含量，胸腺組織中的 SOD 活力、MDA 含量及 Western blot 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，每組中的樣本數(shù)用n表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 安五脂素對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果如圖1所示，與CON 組相比，MOD 組小鼠胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與MOD 組比較，安五脂素中劑量組和高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。安五脂素各劑量組小鼠胸腺指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 安五脂素對(duì)小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影響 結(jié)果如圖2 所示，與CON 組比較，MOD 組小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量顯著減少（P＜0.01），給予安五脂素后各劑量組小鼠血清中IL-2 含量均顯著升高（P＜0.01），IFN-γ 含量在安五脂素低劑量組和高劑量組顯著升高（P＜0.05）。安五脂素各劑量組兩兩比較，IL-2 和IFN-γ 含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 安五脂素對(duì)小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影響Fig.2 Effects of Anwulignan on serum IL-2 and IFN-γ contents in serum of mice

2.3 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織病理變化的影響為了評(píng)價(jià)安五脂素對(duì)胸腺組織形態(tài)學(xué)的影響，對(duì)各組小鼠胸腺進(jìn)行HE 染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察胸腺組織形態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，在CON 組中，皮質(zhì)髓質(zhì)分界清晰，胸腺細(xì)胞密集分布，沒(méi)有巨噬細(xì)胞，胸腺小體分散分布，大小不等，可見(jiàn)少數(shù)胸腺上皮細(xì)胞；MOD 組小鼠的胸腺皮質(zhì)顏色淡染，胸腺細(xì)胞數(shù)目減少，且在皮質(zhì)深層可觀察到巨噬細(xì)胞吞噬正常胸腺細(xì)胞，髓質(zhì)中胸腺小體數(shù)目減少；安五脂素低劑量組與MOD 組相比，胸腺細(xì)胞和胸腺小體數(shù)目明顯增多，且吞噬現(xiàn)象得到明顯緩解；安五脂素中劑量組與MOD 組相比，上述現(xiàn)象有一定程度的緩解，但效果不如安五脂素低劑量組明顯；安五脂素高劑量組與MOD 組相比，胸腺細(xì)胞和胸腺小體數(shù)目減少，吞噬現(xiàn)象緩解，胸腺上皮細(xì)胞增生。

圖3 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織病理學(xué)改變的影響（×200）Fig.3 Effects of Anwulignan on histopathology changes in thymus tissue of mice（×200）

2.4 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中SOD 活力及MDA含量的影響 結(jié)果如圖4 所示，與CON 組相比，MOD 組小鼠胸腺組織中SOD 活力顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）。給予安五脂素后，中劑量組和高劑量組胸腺組織中SOD 活力顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。安五脂素三個(gè)劑量組組間比較顯示：高劑量組胸腺中MDA含量與低劑量組相比顯著降低（P＜0.01），其他安五脂素劑量組對(duì)SOD 活力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中SOD活力和MDA含量的影響Fig.4 Effects of anwulignan on activity of SOD and content of MDA in thymus tissue of mice

2.5 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響 本研究應(yīng)用Western blot 方法對(duì)各組小鼠胸腺組織的相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖5A、C，與CON 組比較，MOD 組Nrf2 和HO-1 的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），Keap1 的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；給予安五脂素后，各劑量組Nrf2、HO-1 的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Keap1的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與安五脂素低劑量組相比，安五脂素中劑量組胸腺中Nrf2、HO-1和Caspase3 的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；安五脂素高劑量組胸腺中Nrf2 的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。安五脂素中劑量組及高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 安五脂素對(duì)小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3，Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Anwulignan on Keap1，Nrf2，HO-1，Caspase3，Bcl2，and Bax protein of mice

如圖 5B、D 所示，與 CON 組比較，MOD 組 Bax 和Caspase3 的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl2 的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。給予安五脂素后，各劑量組Caspase3 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bax 在安五脂素低劑量組和中劑量組的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2 在安五脂素中劑量組和高劑量組的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與安五脂素中劑量組相比，安五脂素高劑量組小鼠胸腺中Bcl2和Caspase3的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；安五脂素低劑量組胸腺中Caspase3蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其余安五脂素給藥組兩兩比較對(duì)上述指標(biāo)的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

近年來(lái)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過(guò)從大體結(jié)構(gòu)到微觀結(jié)構(gòu)，從整體到細(xì)胞甚至基因?qū)λダ系陌l(fā)生機(jī)理進(jìn)行了一系列研究，已形成了多種理論學(xué)說(shuō)，其中衰老的自由基學(xué)說(shuō)和免疫衰老學(xué)說(shuō)是衰老過(guò)程中具有代表性的學(xué)說(shuō)［23-24］。自由基衰老學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基是引起氧化應(yīng)激的重要因素，大量的自由基在體內(nèi)的積累破壞了機(jī)體器官的結(jié)構(gòu)和功能，造成了機(jī)體的損傷和衰老［25］。免疫衰老學(xué)說(shuō)認(rèn)為隨著衰老的發(fā)展，胸腺等免疫器官逐漸萎縮，免疫細(xì)胞發(fā)生退化性改變，導(dǎo)致免疫功能減退，免疫相關(guān)疾病發(fā)病率增多［1，22］。D-gal 是一種還原性糖，是構(gòu)建衰老模型的經(jīng)典方法。過(guò)量的D-gal會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自由基增多，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成與自然衰老相似的機(jī)體損傷，包括胸腺等免疫器官在內(nèi)的機(jī)體多個(gè)器官的損傷［26-28］。本研究連續(xù)皮下注射D-gal 后，小鼠胸腺指數(shù)顯著降低，胸腺結(jié)構(gòu)受到損傷，這與既往研究報(bào)道一致［29-32］。而預(yù)防性給予安五脂素后，D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠胸腺萎縮及胸腺結(jié)構(gòu)損傷被顯著改善，具有顯著的胸腺保護(hù)功能。IL-2 和IFN-γ 是由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，體現(xiàn)出輔助性T 細(xì)胞的主要生物學(xué)效應(yīng)，是機(jī)體重要的免疫功能指標(biāo)［33-34］。在免疫衰老中，以T 細(xì)胞功能受損最為明顯，IL-2 和IFN-γ 隨年齡的增長(zhǎng)產(chǎn)生減少，目前被認(rèn)為是免疫老化的主要分子基礎(chǔ)［35-36］。本研究結(jié)果顯示，在給予安五脂素后，小鼠血清中IL-2 和IFN-γ含量增多，提示安五脂素可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)IL-2和IFN-γ的水平，進(jìn)而改善其免疫功能。

SOD 是機(jī)體最主要的抗氧化酶，在生物氧化過(guò)程中能夠有效地清除自由基［37-39］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，是反應(yīng)自由基所致的機(jī)體損傷的重要指標(biāo)，其含量隨著機(jī)體的衰老程度而升高［40-41］。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，安五脂素能夠明顯提高D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠血清、肝臟組織、腦組織和脾臟組織中SOD活性，降低MDA的含量［20-22］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)D-gal處理小鼠胸腺組織的檢測(cè)結(jié)果與上述結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證實(shí)安五脂素在D-gal 誘導(dǎo)衰老小鼠中表現(xiàn)出顯著的抗氧化作用，該作用可能是安五脂素保護(hù)胸腺損傷的主要原因之一。

Nrf2/ARE 通路是最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)通路，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，Nrf2上調(diào)并激活下游抗氧化酶，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受能力［42-44］。研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)Nrf2 的活性，可有效對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減輕機(jī)體免疫器官損傷［45-46］。Keap1 是Nrf2 負(fù)調(diào)控因子，HO-1 是體內(nèi)較強(qiáng)的抗氧化劑，受 Nrf2 的調(diào)控［47］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng) D-gal處理后，小鼠胸腺組織Keap1表達(dá)水平顯著升高，而Nrf2 及HO-1 表達(dá)水平顯著降低。而給予安五脂素能夠下調(diào)D-gal 處理的衰老小鼠胸腺組織中Keap1蛋白的表達(dá)水平，而上調(diào)Nrf2，HO-1 蛋白的表達(dá)水平，提示安五脂素可能通過(guò)激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路而發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而改善D-gal對(duì)小鼠胸腺組織的損傷。

大量氧自由基可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)及酶變性和DNA 損傷等途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而組織細(xì)胞凋亡是機(jī)體衰老的主要特征之一［48-49］。免疫細(xì)胞凋亡與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)免疫功能變化的重要指標(biāo)［50］。作為細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，以Bcl2 為代表的抗凋亡蛋白以及以Bax 為代表的促凋亡蛋白的表達(dá)水平高低決定細(xì)胞凋亡發(fā)生的走向［51-53］。研究表明，凋亡最終由Caspase 家族完成，而Caspase3 處于Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心位置，是最重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白［54］。有研究表明，Nrf2 可以通過(guò)與Bcl2 基因相關(guān)反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控Bcl2 表達(dá)和細(xì)胞凋亡過(guò)程。而通過(guò)使用Nrf2 抑制劑，可以使Bcl2 表達(dá)減少，Bax 表達(dá)增加，促進(jìn)凋亡的發(fā)生［55-56］。本研究結(jié)果顯示，D-gal 處理后，小鼠胸腺組織Bax 及Caspase3 表達(dá)水平顯著升高，而B(niǎo)cl2 表達(dá)水平顯著降低。給予安五脂素能夠上調(diào)D-gal 處理小鼠胸腺組織中Bcl2 的表達(dá)水平，下調(diào)Bax 及Caspase3 的表達(dá)水平，提示安五脂素可能通過(guò)抑制D-gal 處理小鼠胸腺組織的細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮相關(guān)的保護(hù)作用，該抗凋亡作用可能與安五脂素激活Nrf2，進(jìn)而調(diào)控Bcl2 的表達(dá)有關(guān)，其相關(guān)機(jī)制將在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探討。

本研究選擇1、2及4 mg/kg 3個(gè)劑量觀察安五脂素對(duì)D-gal 處理小鼠胸腺損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，高劑量組安五脂素對(duì)各檢測(cè)指標(biāo)的影響差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)3 個(gè)劑量組組間比較，不同劑量組小鼠胸腺 MDA 含量、Nrf2、HO-1 及 Bcl2、Caspase3表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示安五脂素對(duì)D-gal 誘導(dǎo)小鼠胸腺損傷的保護(hù)作用可能與劑量大小有關(guān)。但值得注意的是，安五脂素對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、IL-2 和 IFN-γ 含量、SOD 活力等指標(biāo)的影響在3 個(gè)劑量組組間比較時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能由于安五脂素針對(duì)不同指標(biāo)的劑量效應(yīng)關(guān)系不同所致，也可能與實(shí)驗(yàn)本身的靈敏度不同有關(guān)，其具體的劑量效應(yīng)關(guān)系及相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探討。

綜上，本研究證實(shí)了安五脂素對(duì)D-gal致衰老小鼠的胸腺組織具有保護(hù)作用，該作用可能與安五脂素激活Nrf2/ARE 通路，進(jìn)而在衰老小鼠胸腺組織中發(fā)揮的抗氧化及抗凋亡作用有關(guān)。