按不同時間方案注射的乙肝免疫球蛋白與乙肝疫苗對小鼠脾臟淋巴細胞亞群的影響①

閆柳柳 王 爽 張 曉 魏 濤 韓 迪 張 磊 （青島大學，青島 266000）

乙型肝炎在全世界范圍流行［1-2］。中國是乙肝大國，1992 年衛生部乙肝血清流行病調查數據顯示中國有1.2 億乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）攜帶者，給患者、家庭及社會帶來沉重的負擔［3］。接種乙肝疫苗是預防HBV 感染最經濟有效的措施［4］。我國于1992年將乙肝疫苗納入免疫規劃，已取得顯著成效［5-6］。2017 年數據顯示HBV 攜帶者約7 000 萬，較1992 年明顯下降［7］；2019 年數據顯示乙肝表面抗原陽性率為5%～6%，較1992 年的9.8%、2006 年的7.2%明顯下降［5，8］。乙肝疫苗納入計劃免疫的20 余年來，也隨之產生了新問題，即當年納入計劃免疫的人群已經進入孕齡期，近年數據顯示孕齡期人群乙肝表面抗體（抗-HBs）陽性率可達56%～59%［9-10］。母體抗-HBs可通過胎盤傳給胎兒，前期人群調查及動物實驗結果均提示新生兒體內來自母親的抗-HBs 會影響乙肝疫苗誘導的體液免疫應答效果［9，11-12］。進而推測，推遲接種乙肝疫苗或許會獲得更好的免疫應答效果。主動免疫包括體液免疫與細胞免疫，若細胞免疫也受影響，上述問題將成為一個亟須解決的公共衛生問題。由于倫理、規范等因素限制，課題組通過小鼠實驗對上述問題進行探討。本研究從細胞水平探討按不同時間方案注射的乙肝免疫球蛋白與乙肝疫苗對BALB/c 小鼠脾臟淋巴細胞亞群的影響，進而分析在抗-HBs 存在的前提下，推遲接種乙肝疫苗是否有助于體液免疫應答，并初步觀察不同注射方案對細胞免疫應答的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級BALB/c 小鼠120 只（雌雄各60 只），購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。每籠5 只小鼠，飼養于青島大學醫學部動物中心小鼠飼養室。飼養環境清潔，溫度22～25 ℃，濕度40%～60%，12 h 晝夜交替，自由飲水和攝入標準飼料。本動物實驗獲青島大學附屬青島市市立醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑與儀器 乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin，HBIG）購自山東泰邦生物制品有限公司；漢遜酵母重組乙型肝炎疫苗購自大連漢信生物制藥有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Hyclone 公司；紅細胞裂解液、PBS購自北京索萊寶科技有限公司；PE anti-mouse CD3、PE-Vio770 anti-mouse CD4、FITC anti-mouse CD8a 和PerCP-Vio700 anti-mouse CD19 均購自德國美天旎生物技術有限公司；貝克曼DxFLEX 流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 所有小鼠根據HBIG 與第1 針乙肝疫苗接種時間間隔分為3 組，每組按乙肝疫苗接種劑量分為2個亞組，見表1。小鼠于第3針乙肝疫苗接種后4 周提取脾臟淋巴細胞。HBIG 為腹腔注射，乙肝疫苗為后肢肌肉注射。

表1 小鼠分組及免疫方案Tab.1 Mice grouping and immunization schedule

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細胞分離及檢測 分離小鼠脾臟，置于含1 ml RPMI1640 培養基液的無菌培養皿內輕輕研磨。將獲得的細胞懸液轉移至1.5 ml Ep 管，20 ℃、1 500 r/min 離心2 min 后棄上清。加入700 μl紅細胞裂解液，裂解時間為2 min。加700 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，20 ℃、1 500 r/min離心2 min 后棄上清。加入1 ml 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液重懸細胞，通過細胞過濾器（400 目）過濾至另一個1.5 ml Ep 管。調整細胞濃度至1.0×106個/ml。取100 μl 細胞懸液，將熒光抗體按說明書比例加入細胞懸液，避光靜置10 min，然后以20 ℃、300 g 離心5 min，棄上清，以200～300 μl PBS重懸細胞。使用流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+）所占比例。1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS22.0統計軟件進行處理。淋巴細胞亞群比例以父群%表示，計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 按不同時間方案注射的HBIG 及乙肝疫苗影響小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例 在乙肝疫苗劑量為1 μg的小鼠中，CD3+及CD3+CD4+T淋巴細胞在3組中所占比例差異在雄、雌鼠中均有統計學意義，其共同點為2 周組所占比例最高，4 周組最低。CD3+CD8+T淋巴細胞在三組中所占比例差異在雄鼠中有統計學意義，其中2 周組所占比例最高，4 周組最低。三組CD4/CD8 在雄、雌鼠中差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.001），其共同點為2 周組所占比例最高，4 周組最低。CD3-CD19+B 淋巴細胞在3 組中所占比例差異在雄、雌鼠中差異均有統計學意義（P=0.003，P＜0.001），其共同點為4周組CD3-CD19+B淋巴細胞所占比例最高，2 周組最低。組間比較見表2，組內比較見圖1、圖2。

表2 按不同時間方案注射的HBIG與1 μg乙肝疫苗對小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響（±s，n=60）Tab.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

表2 按不同時間方案注射的HBIG與1 μg乙肝疫苗對小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響（±s，n=60）Tab.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

Groups Male Female Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+0 week/%37.63±7.34 26.74±5.25 10.49±2.50 2.59±0.35 41.71±5.08 44.93±12.08 31.81±8.80 11.70±3.37 2.74±0.38 32.29±9.45 2 week/%42.51±6.35 30.54±5.40 11.06±1.20 2.75±0.31 40.62±3.98 49.29±10.21 36.26±6.90 10.45±3.99 3.70±0.89 27.66±7.15 4 week/%31.63±5.20 21.05±4.40 8.95±1.44 2.35±0.36 47.54±3.72 34.00±3.98 23.24±3.21 9.15±1.00 2.54±0.17 44.49±3.65 F 7.346 8.980 3.645 3.455 7.501 6.998 9.697 1.721 12.056 14.759 P 0.003 0.001 0.040 0.046 0.003 0.004 0.001 0.198＜0.001＜0.001

圖1 按不同時間方案注射的HBIG 與1 μg 乙肝疫苗對雄鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響Fig.1 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in male mice

圖2 按不同時間方案注射的HBIG 與1 μg 乙肝疫苗對雌鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響Fig.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in female mice

在乙肝疫苗劑量為2 μg 的小鼠中，CD3+、CD3+CD4+T 淋巴細胞在3 組中所占比例差異在雄、雌鼠中差異均有統計學意義，其共同點為2 周組所占比例最高，4 周組最低。CD3+CD8+T 淋巴細胞在3 組中所占比例差異在雄、雌鼠中均有統計學意義（P=0.001 或P＜0.001），其中雄鼠中在2周組所占比例最高，4周組最低，雌鼠中在0周組所占比例最高，4周組最低。3組CD4/CD8在雌鼠中差異有統計學意義（P＜0.001），2周組最高，0周組最低。CD3-CD19+B淋巴細胞在3 組中所占比例差異在雄、雌鼠中均有統計學意義，其共同點為4 周組CD3-CD19+B 淋巴細胞所占比例最高，0 周組最低。組間比較見表3，組內比較見圖3、圖4。

圖3 按不同時間方案注射的HBIG 與2 μg 乙肝疫苗對雄鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響Fig.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in male mice

圖4 按不同時間方案注射的HBIG 與2 μg 乙肝疫苗對雌鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響Fig.4 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in female mice

表3 按不同時間方案注射的HBIG與2 μg乙肝疫苗對小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響（±s，n=60）Tab.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

表3 按不同時間方案注射的HBIG與2 μg乙肝疫苗對小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例的影響（±s，n=60）Tab.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

Groups Male Female Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+0 week/%38.03±7.95 28.17±6.12 10.33±2.67 2.76±0.24 36.43±5.41 43.70±5.55 30.16±4.23 13.69±1.99 2.21±0.13 30.79±2.38 2 week/%45.97±9.41 31.93±7.14 11.30±2.66 2.84±0.28 38.97±10.40 48.09±10.55 35.21±7.68 9.45±2.46 3.79±0.44 34.76±13.17 4 week/%27.64±2.27 19.32±1.86 6.91±0.61 2.81±0.32 52.66±4.43 30.34±3.44 20.72±2.98 7.86±1.14 2.67±0.37 49.16±4.98 F 14.419 12.265 9.706 0.199 13.708 16.642 18.943 24.107 56.322 13.733 P＜0.001＜0.001 0.001 0.821＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 乙肝疫苗劑量影響小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例 在0周組、2周組及4周組中，分別分析每組中乙肝疫苗劑量對淋巴細胞亞群的影響。見表4、表5。在雄鼠中，0 周組CD3-CD19+B 淋巴細胞比例在1 μg組高于2 μg 組，差異有統計學意義（P=0.037）；2 周組中各指標差異均無統計學意義；4 周組中CD3+、CD3+CD8+T 淋巴細胞比例在1 μg 組高于2 μg 組，差異有統計學意義（P=0.048，P=0.001），CD4/CD8 在1 μg組低于2 μg組，差異有統計學意義（P=0.010），CD3-CD19+B 淋巴細胞比例在1 μg 組低于2 μg 組，差異有統計學意義（P=0.014）。

表4 乙肝疫苗劑量對雄鼠脾臟淋巴細胞亞群的影響（±s，n=60）Tab.4 Effect of hepatitis B vaccine dose on proliferation of splenic lymphocyte subsets in male mice（±s，n=60）

Groups 0 week 2 week 4 week Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+1 μg 37.63±7.34 26.74±5.25 10.49±2.50 2.59±0.35 41.71±5.08 42.51±6.35 30.54±5.40 11.06±1.20 2.75±0.31 40.62±3.98 31.63±5.20 21.05±4.40 8.95±1.44 2.35±0.36 47.54±3.72 2 μg 38.03±7.95 28.17±6.12 10.33±2.67 2.76±0.24 36.43±5.41 45.97±9.41 31.93±7.14 11.30±2.66 2.84±0.28 38.97±10.40 27.64±2.27 19.32±1.86 6.91±0.61 2.81±0.31 52.66±4.43 t-0.117-0.562 0.137-1.264 2.252-0.949-0.483-0.253-0.661-0.447 2.126 1.094 3.928-2.902-2.740 P 0.908 0.581 0.893 0.222 0.037 0.356 0.635 0.803 0.517 0.664 0.048 0.289 0.001 0.010 0.014

表5 乙肝疫苗劑量對雌鼠脾臟淋巴細胞亞群的影響（±s，n=60）Tab.5 Effect of hepatitis B vaccine dose on proliferation of splenic lymphocyte subsets in female mice（±s，n=60）

Groups 0 week 2 week 4 week Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+1 μg 44.93±12.08 31.81±8.80 11.70±3.37 2.74±0.38 32.29±9.45 49.29±10.21 36.26±6.90 10.45±3.99 3.70±0.89 27.66±7.15 34.00±3.98 23.24±3.21 9.15±1.00 2.54±0.17 44.49±3.65 2 μg 43.70±5.55 30.16±4.23 13.69±1.99 2.21±0.13 30.79±2.38 48.09±10.55 35.21±7.68 9.45±2.46 3.79±0.44 34.76±13.17 30.34±3.44 20.72±2.98 7.86±1.14 2.67±0.37 49.16±4.98 t 0.292 0.535-1.610 4.232 0.485 0.260 0.319 0.676-0.261-1.498 2.199 1.820 2.688-0.998-2.388 P 0.773 0.600 0.125 0.001 0.638 0.798 0.753 0.508 0.797 0.156 0.041 0.085 0.015 0.331 0.028

在雌鼠中，0 周組CD4/CD8 在1 μg 組高于2 μg組，差異有統計學意義（P=0.001）；2 周組中各指標差異均無統計學意義；4 周組中CD3+、CD3+CD8+T 淋巴細胞比例在1 μg組高于2 μg組，差異有統計學意義（P=0.041，P=0.015），CD3-CD19+B 淋巴細胞比例在1 μg 組低于2 μg 組（P=0.028），差異有統計學意義。

3 討論

HBIG 由體內含有滴度較高抗-HBs 的健康獻血員血漿中篩選，經生物濃縮工藝制成，其實質即為抗-HBs［13-14］。本研究通過給小鼠注射HBIG 模擬新生兒從母體獲得抗-HBs，此模型經前期實驗證實可行［12］。小鼠為乙肝疫苗誘導免疫反應的常用動物［15-20］。脾臟是小鼠重要的免疫器官，是成熟淋巴細胞定居的場所，也是T 淋巴細胞介導細胞免疫和B 淋巴細胞介導體液免疫應答發生的場所［21］。以上是本研究實施的理論與實踐依據。3 組小鼠在注射HBIG 后，接種第1 針乙肝疫苗的時間不同，分別為與HBIG 同時注射（0 周時注射），2 周時注射及4 周時注射，以期觀察推遲接種乙肝疫苗是否能避免HBIG 的中和作用，提高乙肝疫苗免疫效果。本研究主要檢測與T、B 淋巴細胞相關的經典指標，即CD3+T 淋巴細胞及其亞群（CD3+CD4+輔助性T 細胞和CD3+CD8+細胞毒性T 細胞）、CD3-CD19+B 淋巴細胞。

研究結果顯示，0、2、4 周組中并未顯示推遲接種乙肝疫苗會增強細胞免疫效果，即提示HBIG 并未影響乙肝疫苗誘導的細胞免疫效果。但這三組中，2周組CD3+及CD3+CD4+T淋巴細胞比例在雄、雌鼠中均顯著高于0周及4周組，CD3+CD8+T淋巴細胞比例在雄鼠中2 周組顯著高于其他兩組。2 周組注射HBIG 后2 周注射第1 針乙肝疫苗，其誘發較強的細胞免疫效果的機制尚不清楚。有研究報道，CD3+CD4+T淋巴細胞比例在乙肝疫苗無應答組中低于乙肝疫苗高應答組，而CD3+CD8+T 淋巴細胞比例在上述兩組中的比例與CD3+CD4+T 淋巴細胞分布相反［22］。本研究結果顯示，在4 周組，即HBIG 對乙肝疫苗阻抑較小時，CD3+CD8+T淋巴細胞比例最低，與上述結果不矛盾，但CD3+CD4+T 淋巴細胞比例在4 周組最低，與上述結果并不一致。CD4/CD8 在1 μg 組雄、雌鼠中及2 μg 組雌鼠中均顯示2 周組高于其他兩組，差異有統計學意義。CD4/CD8 升高提示自身免疫性疾病、病毒性感染、變態反應降低，提示艾滋病、惡性腫瘤的進展和復發。本研究各組中CD4、CD8 的比例并未顯示相反的趨勢，因此二者比值并未顯示出HBIG 與乙肝疫苗免疫效果的關系。另有文獻報道，母體抗體對新生兒接種的多種疫苗誘導的細胞免疫均無影響［23］。關于HBIG 是否阻抑乙肝疫苗誘導的細胞免疫效果還有待進一步研究。

本研究中，CD3-CD19+B 淋巴細胞在1 μg、2 μg組雄、雌鼠中均顯示4 周組中所占比例最高，與0 周組、2 周組比較差異有統計學意義，提示推遲接種乙肝疫苗受HBIG阻抑作用較小，有利于B淋巴細胞增殖。B 淋巴細胞與體液免疫密切相關，該結果進一步提示HBIG 會影響乙肝疫苗的免疫應答，推遲注射乙肝疫苗會取得更好的體液免疫效果，這與前期研究結果一致［9，12］。WEERATNA 等［15］報道，小鼠體內存在高滴度母源性抗-HBs 的前提下，B 淋巴細胞對不同種類乙肝疫苗誘導的免疫應答均較差，本研究結果與上述報道一致。本研究在細胞水平的結果也提示母體抗體通過胎盤傳遞給胎兒會中和出生后注射的乙肝疫苗，影響乙肝疫苗的主動免疫效果。

另外，以上各組組內比較顯示，4 周組中CD3-CD19+B 淋巴細胞比例分別高于0 周組及2 周組，差異有統計意義，而0 周組與2 周組相比差異無統計意義。該結果或許提示50 IU HBIG 在2 周時仍會阻抑乙肝疫苗的主動免疫效果，而到4 周時其對乙肝疫苗的阻抑作用明顯減弱，這或許提示將乙肝疫苗推遲到4周時接種既會避免來自母親抗-HBs的中和作用，又在抗-HBs 消散前盡早接種乙肝疫苗，以避免感染HBV。有文獻報道，來自母體的抗-HBs 在前四周下降幅度最大，而后下降趨勢減緩［15］。關于母體抗-HBs 陽性的新生兒接種乙肝疫苗，4 周是否是最佳的接種時間點有待進一步研究。AGLADIOGLU 等［24］對在土耳其實施的兩種乙肝疫苗接種方案做比較，發現2-4-9 月方案較0-2-9 月方案可取得更好的免疫效果，該結果進一步證實了本研究觀點的合理性。

本研究得出乙肝疫苗劑量對T淋巴細胞亞群無顯著影響，但4 周組注射1 μg 乙肝疫苗的雄鼠和雌鼠CD3-CD19+B 淋巴細胞所占比例低于注射2 μg 的雄鼠和雌鼠，差異有統計學意義，該結果提示高乙肝疫苗劑量會獲得更好的體液免疫效果，這與前期研究結果一致［12］。接種較大劑量的乙肝疫苗有利于提高保護率，這在兒童及成人的調查研究中已得到證實［25-26］，本研究結果與上述報道結果一致。

本研究尚存在一些局限性：本研究根據HBIG與第1 針乙肝疫苗注射的時間間隔分為3 大組，結果顯示在HBIG 存在的前提下，推遲接種乙肝疫苗可獲得更好的體液免疫應答效果，而與細胞免疫應答相關的指標在不同組中未顯示明顯差別。該結果提示HBIG 會影響乙肝疫苗的體液免疫應答效果，對細胞免疫應答無明顯影響。因本研究未設僅注射乙肝疫苗組作為對照，不能肯定本研究結果提示的結論，要證實該結論，有待優化實驗設計方案做進一步研究。另外，本研究模擬的是新生兒從母體獲得抗-HBs 這一現象，最理想的動物模型是用疫苗接種孕鼠，從而對獲得母傳抗體的幼鼠進行免疫接種。由于同期納入符合要求的孕鼠難度大、可行性差，且幼鼠接種疫苗死亡率高、實驗操作性差，故本研究采用給成年小鼠注射HBIG 模擬其從母體獲得抗-HBs的方法進行實驗。

本實驗通過給小鼠注射HBIG 模擬母鼠抗體轉運至子代，為探討母體抗-HBs 對新生兒接種乙肝疫苗的影響提供實驗模型。本研究結果提示乙肝疫苗誘導的免疫應答以體液免疫為主，若母體內存在高滴度抗-HBs，其子代適當推遲接種乙肝疫苗的時間會提高乙肝疫苗誘導的體液免疫效果。鑒于為了避免母親抗體的中和作用，新生兒麻疹疫苗的首劑接種時間為出生后8月齡［27-28］。結合本研究結果，課題組提出優化乙肝疫苗接種方案的問題，旨在希望該問題引起社會的關注，進而通過更多研究進一步證實。