孕酮和骨化三醇通過miR-590-5p靶向RelA調控子宮內膜癌細胞Ishikawa的細胞因子分泌

趙麗潔 趙 慧 郭 丹 林麗紅 （安陽職業技術學院，安陽 455000）

細胞因子/趨化因子是癌癥相關炎癥的關鍵因素，越來越多的證據表明，腫瘤細胞產生的趨化因子是其轉移介質［1］。NF-κB 是一種強大的促炎調節劑，在腫瘤中被組成激活，并將炎癥和致癌作用聯系起來［2］。NF-κB 控制多種功能400 余個基因的表達，這些功能包括炎癥、生長、凋亡、侵襲和轉移［2］。其通常在細胞中處于靜止狀態，并且僅在響應壓力信號（例如促炎性細胞因子）時被激活［2］。NF-κB 由一系 列亞 基組 成，包括RelA、RelB、c-Rel、p50、p52［2］。子宮內膜癌是常見的婦科惡性腫瘤［3］。炎癥過程伴隨著月經周期內膜的正常生長，脫落和修復，這由性激素控制，也可能由炎癥介質自身控制［4］。此外，慢性炎癥可能通過內在（促進腫瘤）及外在（引發腫瘤）癌癥途徑在子宮內膜癌發展中發揮重要作用［5］。已有研究表明孕酮和骨化三醇抑制子宮內膜癌細胞生長和細胞因子分泌［6-7］。但孕酮和骨化三醇抑制子宮內膜癌細胞因子分泌的分子機制尚不清楚。因此，本研究以子宮內膜癌細胞Ishikawa 為研究對象，旨在探討孕酮和骨化三醇處理Ishikawa細胞減少細胞因子分泌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 子宮內膜癌細胞（Ishikawa）購自廣州速研生物科技有限公司（貨號：Ishikawa）。RelA、RelB、c-Rel、p50、p52、GAPDH 抗體購自Abcam 公司（貨 號：ab16502、ab33907、ab133251、ab133492、ab264236、ab8245）。胎牛血清購自廣州市左克生物科技發展有限公司（貨號：HQ30071）。孕酮購自上海賢鼎生物科技有限公司（貨號：PG427-25g）。第一鏈cDNA 合成試劑盒購自北京蘭博利德商貿有限公司（貨號：C1802）。骨化三醇購自廣州市左克生物科技發展有限公司（貨號：C3078-1MG）。青鏈霉素混合液（100×）購自上海億言生物科技有限公司（貨號：SL6040-100ml）。hsa-miR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-493-3p的mimics 和qPCR 引物均由北京擎科合成。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京邁瑞達科技有限公司（貨號：M052460-500T）。siRelA 由吉凱基因合成。轉染試劑購自廣州一科生物科技有限公司（貨號：BB-4601-2）。RelA 基因從Ishikawa cDNA 中擴增并插入pCDNA3.1，記為pCDNA3.1-RelA。pEZX-MT01購自BioVector 質粒載體菌種細胞基因保藏中心（貨號：pEZX-MT01）。RT2 First Strand 試劑盒購自昆明皇寶商貿有限公司（貨號：330404）。熒光素酶標記試劑盒購自廣州一科生物科技有限公司（貨號：A1001-8）。DMEM/F12培養基購自廣州泰勒生物科技有限公司（貨號：SH30023.01）。Trizol購自派瑞金（北京）生物科技有限公司（貨號：T8361）。CXCL1 ELISA 試劑盒購自上海群己生物科技有限公司（貨號：KA3337）。CXCL2 ELISA 試劑盒購自廣州徠智生物科技有限公司（貨號：BS-E6201H1）。TNF-α ELISA 試劑盒購自廣州一科生物科技有限公司（貨號：EK0584）。IL-1β ELISA 試劑盒購自北京萊科百奧生物技術有限公司（貨號：JL29721）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 Ishikawa 細胞于含10%FBS 及1%P/S 的DMEM/F12 培 養 基 中，37 ℃、5%CO2培養。分別用25 μmol/L 孕酮、100 μmol/L 骨化三醇處理Ishikawa細胞72 h，進行下游實驗。hsamiR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsamiR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-493-3p 的mimics、miR-590-5p inhibitor、siRelA及pCDNA3.1-RelA 與轉染試劑以1∶3 比例混合，室溫靜置15 min，緩慢滴入Ishikawa細胞。

1.2.2 RNA 抽取與實時熒光定量PCR RNA 提取試劑盒從對照，分離Ishikawa 細胞總RNA。DNase處理后，通過RT2 First Strand 試劑盒按說明合成cDNA。按說明應用7500RT-PCR 系統（AB Applied Biosciences）定量逆轉錄酶PCR（RT-PCR）。采用2-ΔΔCt法確定相對基因表達。

1.2.3 熒光素酶報告實驗 熒光素酶報告質粒pEZX-MT01 包含RelA 野生型或突變型3'UTR。采用熒光素酶報告基因系統分析熒光素酶活性前，分別將miR-590-5p 及陰性對照（NC）與熒光素酶報告基因共轉染至Ishikawa細胞（1×104個）48 h。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗 25 μmol/L 孕酮及100 μmol/L骨化三醇分別處理Ishikawa細胞72 h，測定CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-1β 分泌水平。收獲Ishikawa 細胞上清。通過BCA 蛋白測定上清液總蛋白濃度，應用相應ELISA 試劑盒一式兩份定量靶蛋白表達。

1.2.5 免疫印跡 應用針對NF-κB 亞基RelA、RelB、c-Rel、p50、p52 的抗體分析孕酮、骨化三醇處理以及未處理的Ishikawa 細胞提取物。對等量蛋白質進行SDS-PAGE 電泳，分析細胞內GAPDH 為上樣對照。按照制造商（Pierce）建議，增強后化學發光系統用于可視化蛋白質條帶。采用Image J 軟件對免疫印跡條帶結果進行定量分析。

1.2.6 RNA-Seq 通過Trizol法抽取孕酮和骨化三醇處理后Ishikawa 細胞總RNA、未處理的Ishikawa細胞總RNA。樣品送至北京基因組研究所（中國深圳）進行商業性RNA-Seq 服務和數據分析。應用SOAPaligner/SOAP2 不匹配，將明確讀段映射到human 數據庫。計算每個基因純凈讀數數，將其標準化為每百萬分之一讀數（TKM），該讀數將讀數數與基因表達相關。利用log2 比率確定基因調控，選擇log2 比率為-1或log2比率為1的差異基因進一步分析。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS18.0 處理。數據以表示，統計學比較采用雙尾學生t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕酮和骨化三醇抑制Ishikawa 細胞細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 分泌 孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細胞后，酶聯免疫吸附實驗發現細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 分泌水平明顯下降（P＜0.05，圖1A～D），實時熒光定量PCR 發現細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 的mRNA表達均顯著降低（P＜0.05，圖1E）。

圖1 孕酮和骨化三醇抑制Ishikawa 細胞細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2分泌Fig.1 Progesterone and calcitriol inhibit secretion of cytokines IL-1β，TNF-α，CXCL1 and CXCL2 in Ishikawa cells

2.2 孕酮和骨化三醇在mRNA 水平下調NF-κB 亞基RelA 表達 孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa細胞后，免疫印跡發現NF-κB 亞基RelA 表達下調，NF-κB 亞基RelB、c-Rel、p50、p52 表達無明顯改變（圖2A、B）。定量結果見圖2C。轉染RelA promoter-luciferase 質粒后，應用孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細胞，發現其熒光素酶報告活性變化差異無統計學意義（P＞0.05，圖3A），實時熒光定量PCR發現NF-κB 亞基RelA mRNA 水平降低（P＜0.05，圖3B）。

圖2 孕酮和骨化三醇處理后NF-κB亞基表達Fig.2 Expression level of NF-κB subunit after progesterone and calcitriol treatment

圖3 孕酮和骨化三醇處理后NF-κB 亞基RelA 轉錄水平及啟動子活性Fig.3 Transcription level and promoter activity of NF-κB subunit RelA after treatment with progesterone and calcitriol

2.3 miR-590-5p靶向NF-κB亞基RelA的-3'端非編碼區 使用孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細胞后，通過高通量測序發現孕酮處理后有110 種mi-RNAs表達上調，而骨化三醇處理后有57種miRNAs表達上調（圖4）。兩組均上調者有14種miRNAs，分別 是hsa-miR-584-3p、hsa-miR-1251-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-4455、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-7977、hsa-miR-4468、hsa-miR-5093、hsa-miR-939-3p、hsa-miR-610、hsa-miR-7850-5p、hsa-miR-6134、hsamiR-4789-5p、hsa-miR-493-3p（圖5）。通過miRNA mimics 表達上述miRNA 后，發現miR-590-5p 可降低NF-κB 亞基RelA mRNA 水平（P＜0.05，圖6A）。通過熒光素酶報告實驗發現miR-590-5p 靶向NF-κB亞基RelA-3'端非編碼區（P＜0.05，圖6B）。同時，通過miR-590-5p mimic 過表達miR-590-5p 后，NF-κB亞基RelA蛋白水平降低。通過miR-590-5p inhibitor敲低miR-590-5p 后，NF-κB 亞基RelA 蛋白水平升高（圖6C、D）。定量結果見圖6E。

圖4 孕酮和骨化三醇處理后Ishikawa細胞的高通量測序Fig.4 High-throughput sequencing of Ishikawa cells treated with progesterone and calcitriol

圖5 孕酮和骨化三醇處理Ishikawa細胞的高通量測序結果交集Fig.5 Intersection of high-throughput sequencing results of progesterone and calcitriol treated Ishikawa cells

圖6 miR-590-5p靶向NF-κB亞基RelA的-3'端非編碼區Fig.6 miR-590-5p targets 3' terminal non-coding region of NF-κB subunit RelA

2.4 miR-590-5p靶向NF-κB信號通路調控Ishikawa細胞細胞因子分泌 miR-590-5p mimic 過表達miR-590-5p后，細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2表達均顯著降低（P＜0.05）。miR-590-5p inhibitor 敲低miR-590-5p 后，細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 表達均顯著升高（P＜0.05）。但同時過表達或 敲 低miR-590-5p 和RelA 時，細 胞 因 子IL-1β、TNF-α、CXCL1 和CXCL2 表達無明顯變化（P＞0.05，圖7）。

圖7 miR-590-5p 靶向NF-κB 信號通路調控Ishikawa 細胞細胞因子分泌Fig.7 miR-590-5p targets NF-κB signaling pathway to regulate secretion of cytokines in Ishikawa cells

3 討論

本研究發現孕酮和骨化三醇降低Ishikawa 細胞中細胞因子IL-1β、TNF-α、CXCL1、CXCL2 的表達和分泌。越來越多的證據支持炎癥能夠加速多種癌癥發展和進展［8］。子宮內膜癌是由炎癥驅動的疾病，涉及復雜細胞因子和趨化因子網絡激活［9］。最近的研究表明骨化三醇和孕酮具有抗腫瘤作用［10］，可能是得益于其抑制細胞因子表達和分泌。

臨床、流行病學和基礎科學證據表明，骨化三醇可能是高效的卵巢癌和子宮內膜癌預防劑，可直接調節許多細胞中細胞因子誘導的NF-κB 活性［11-12］。亦可抑制乳腺和前列腺細胞中NF-κB 信號傳導，降低血管生成及促炎性細胞因子IL-8 的水平［13］。孕酮是女性生殖道一種強大的抗炎和抗增殖激素［14］。在分化較差的子宮內膜癌細胞Hec50c中，孕酮顯示 可 以抑制NF-κB 轉錄活性［15］。但GEISERT 等［16］發現孕酮可以激活子宮上皮NF-κB轉錄活性并增加細胞因子表達。提示孕酮與NF-κB轉錄活性具有較高相關性。基于此，本研究使用骨化三醇和孕酮處理后，檢測NF-κB 各個亞基表達，發現NF-κB 亞 基RelA 表達 下 調，而NF-κB 亞 基RelB、c-Rel、p50、p52 表達無明顯改變。因此，孕酮和骨化三醇的作用靶點可能是RelA。孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa 細胞，RelA 啟動子活性變化差異無統計學意義（P＞0.05），但RelA mRNA水平降低（P＜0.05）。提示孕酮和骨化三醇在mRNA 水平降低RelA 表達。miRNA 是一個小型非編碼RNA 分子，包含約22 個核苷酸，在RNA 沉默和基因表達轉錄后調控中起作用［17］。憑借這些特性，miRNA 可以調節參與癌癥發展的多種信號傳導途徑，例如細胞增殖、凋亡和遷移［18］。通過高通量測序發現孕酮和骨化三醇分別處理Ishikawa細胞后，有110種miRNAs表達上調，骨化三醇處理后有57 種miRNAs 表達上調，其中均上調的有14種miRNAs。在這些miRNAs中僅有miR-590-5p 可降低NF-κB 亞基RelA mRNA水平（P＜0.05）。但其他被孕酮和骨化三醇調節的miRNA 是否在抗腫瘤中發揮其他功能值得進一步探索。雖然本研究和GEISERT 等［16］的研究對象都是子宮細胞，但GEISERT 等人應用的模式生物是豬，人和豬的NF-κB 并非完全同源，兩個物種蛋白表達調控機制并不相同，且豬無miR-590-5p 表達，因此孕酮可能導致人和豬產生不同的NF-κB 轉錄活性。

最近miRNA 被引入，有希望成為癌癥治療靶標。miRNA 有抑制腫瘤的調節潛力，可調節細胞內整個信號網絡，這使其成為開發癌癥治療劑的選擇之一［19］。miR-590-5p 可消除細胞因子，有望成為治療子宮內膜癌的新miRNA工具。

綜上所述，孕酮和骨化三醇處理Ishikawa 細胞后miR-590-5p 表達上升，miR-590-5p 靶向NF-κB 亞基RelA 的-3'端非編碼區，降低RelA 蛋白水平，降低NF-κB 復合體活性，最終下調細胞因子IL-1β、TNFα、CXCL1、CXCL2的表達。