lncRNA LSINCT5 通過miR-451 調(diào)控肺癌細胞侵襲、遷移及順鉑敏感性的實驗研究①

熊 瑋 劉慧敏 劉 平 熊印祥 劉 巧

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430077）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近些年來其發(fā)病率及病死率逐年升高，嚴重威脅人們的生命健康［1］。順鉑（cisplatin，DDP）是癌癥治療中廣泛使用的一線化療藥物，但患者接受治療的過程中易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果［2］。目前基因治療聯(lián)合化療增加腫瘤細胞化療敏感性已成為研究熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)，DDP 耐藥與lncRNA 及miRNA 表達異常有關(guān)［3-4］。長 鏈 非 編 碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）為非編碼RNA 的主要成員，在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用已獲得廣泛認可［5］。應(yīng)激誘導(dǎo)長非編碼轉(zhuǎn)錄本5（long stress-induced non-coding transcript 5，LSINCT5）是LSINCT 家族成員之一，在多種腫瘤中表達較高，可促進腫瘤進展［6-7］。有研究顯示，LSINCT5 可通過調(diào)節(jié)HMGA2 促進非小細胞肺癌進展［8］。但LSINCT5對肺癌侵襲、遷移及DDP 敏感性的影響及機制尚未明確。miR-451 是miRNA 家族成員，肺癌細胞中miR-451 低表達，可影響細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程［9］。有研究顯示，敲減LSINCT5 可通過上調(diào)miR-451 抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力［10］。LSINCT5 是否可通過調(diào)節(jié)miR-451 表達影響肺癌細胞生長還未明確。因此，本研究以肺癌A549細胞為研究對象，旨在探討LSINCT5 調(diào)控miR-451 對A549細胞侵襲、遷移及DDP敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌細胞株A549購自美國ATCC 公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公 司；LSINCT5 siRNA 及 陰 性 對 照siRNA、LSINCT5 過表達載體及空載體、miR-451 inhibitor 均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；DDP 購自山東齊魯藥業(yè)股份有限公司；基質(zhì)膠、Transwell 小室均購自美國Corning 公司；E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 抗體購自美國Abcam 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司；總RNA 提取試劑盒購自日本TaKaRa 公司；PCR 儀購自美國ABI公司；顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肺癌細胞A549 在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細胞生長密度達80%左右時，胰酶消化后進行傳代。取生長至對數(shù)期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將肺癌A549 細胞分為LSINCT5 siRNA、DDP（4 μg/ml）、si-LSINCT+DDP+miR-451 inhibitor 處理組，以不經(jīng)特殊處理的細胞為空白組。siRNA 及miR-451 inhibitor 轉(zhuǎn)染方法如下：轉(zhuǎn)染前1 d，細胞計數(shù)后調(diào)整濃度為2×105個/孔，接種于6 孔板，待細胞生長密度達80% 時可進行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體2000 說明書，Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋LSINCT5 siRNA（si-LSINCT5 組）及陰性對照（si-NC組）、LSINCT5 過表達載體（pcDNA3.1-LSINCT5組）及空載體（pcDNA3.1 組）和miR-451 inhibitor 作為A液，Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體2000 作為B 液。輕柔混勻A 液和B 液，室溫放置15 min。將混合液加入6 孔板中，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。4～6 h 后更換為含有血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測LSINCT5 和miR-451 基 因 表達 參照總RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 濃度及純度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將反應(yīng)體系設(shè)置為20 μl，其中cDNA 模板1 μl，上游有引物（10 μmol/L）各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，然后用ddH2O 補足至20 μl。檢測LSINCT5 基因表達時反應(yīng)條件為95 ℃5 min，然后40 個循環(huán)95 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃延伸20 s。檢測miR-451基因表達時反應(yīng)條件為95 ℃30 s，然后35個循環(huán)，循環(huán)條件為94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃延伸1 min。所有引物序列如下：LSINCT5 F 5′-CCAGCUACAAACCUCUGAATT-3′，R 5′-UUCAGAGGUUUGUAGCUGGTT-3′；GAPDH F 5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′，R 5′-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3′；miR-451 F 5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′，R 5′-C-TGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，采用2-ΔΔCt法以GAPDH 或U6 作為內(nèi)參，根據(jù)所得Ct 值計算LSINCT5和miR-451基因相對表達水平。

1.2.4 Transwell 小室檢測細胞侵襲和遷移能力侵襲檢測：將在-80 ℃冰箱保存的Matrigel 基質(zhì)膠放入4 ℃冰箱中，基質(zhì)膠完全溶解后，取出60 μl 基質(zhì)膠與300 μl 無血清培養(yǎng)基混勻，加入至Transwell 小室上室，室溫風(fēng)干。胰酶消化各組細胞，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，配置成細胞懸液，并將細胞密度調(diào)整為1×105個/ml。上室中加入200 μl 細胞懸液，下室加含血清的培養(yǎng)液500 μl，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，PBS 輕輕洗小室3 次。4 ℃下甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗滌2 次。高倍顯微鏡下，隨機選擇5 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。遷移檢測：細胞遷移檢測基本同侵襲檢測，差別在于細胞遷移檢測在Transwell 小室上室不需要鋪基質(zhì)膠，其他操作步驟及結(jié)果分析與侵襲檢測相同。

1.2.5 Western blot 檢 測E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin表達 收集各處理組細胞，PBS洗滌細胞3 次，加適量細胞裂解液，冰上裂解反應(yīng)30 min，離心，吸取上清。BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測提取的蛋白濃度。蛋白樣品與5×loading buffer 混勻，100 ℃煮沸變性10 min。每孔道上等量蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)PVDF 膜及封閉膜后，加入經(jīng)封閉液稀釋的E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin（均1∶500稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜，加HRP標記的二抗（1∶1 000稀釋），37 ℃孵育2 h。洗膜。PVDF膜上滴加ECL 反應(yīng)液，避光靜置2 min，X 光片在暗室中顯影。掃描膠片，凝膠圖像處理系統(tǒng)掃出條帶，Image J軟件分析灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測LSINCT5 和miR-451 靶向關(guān)系 在線靶基因預(yù)測軟件顯示miR-451和LSINCT5 3'UTR 存在結(jié)合位點。為驗證miR-451和LSINCT5 是否有靶向關(guān)系。構(gòu)建LSINCT-野生型（LSINCT-WT）及LSINCT-突變型（LSINCT-MUT）的3'UTR 載體，并與miR-451 mimics 共轉(zhuǎn)染至A549 細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進行分析，計量資料用表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)LSINCT表達可抑制A549細胞侵襲、遷移能力 LSINCT siRNA 轉(zhuǎn)染至A549 細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，通過qRT-PCR、Transwell 小室檢測LSINCT 基因表達及細胞侵襲、遷移數(shù)，結(jié)果如表1、圖1 所示，與空白組比較，si-LSINCT 組LSINCT 基因表達、細胞侵襲遷、移數(shù)均明顯降低（P＜0.05），si-NC 組和空白組LSINCT 基因表達、細胞侵襲、遷移數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 轉(zhuǎn)染LSINCT siRNA 后A549 細胞LSINCT mRNA表達及細胞侵襲、遷移Fig.1 LSINCT mRNA expression and number of invasion and migration of A549 cells transfected with LSINCT siRNA

表1 轉(zhuǎn)染LSINCT siRNA 后A549 細胞LSINCT mRNA表達及細胞侵襲、遷移數(shù)Tab.1 LSINCT mRNA expression and number of invasion and migration of A549 cells after transfected with LSINCT siRNA

2.2 下調(diào)LSINCT 表達可增強DDP 對A549 細胞侵襲、遷移抑制 各組細胞侵襲遷移檢測結(jié)果如表2、圖2 所示，使用LSINCT siRNA 及順鉑單獨處理細胞，細胞侵襲、遷移能力均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而LSINCT siRNA 與DDP聯(lián)合使用對細胞侵襲、遷移抑制更明顯，且與si-LSINCT 組或DDP 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 下調(diào)LSINCT 表達對DDP 誘導(dǎo)的A549 細胞侵襲、遷移的影響Tab.2 Effects of down regulating LSINCT expression on invasion and migration of A549 cells induced by DDP

圖2 下調(diào)LSINCT 表達對DDP 誘導(dǎo)的A549 細胞侵襲、遷移的影響Fig.2 Effects of down regulating LSINCT expression on invasion and migration of A549 cells induced by DDP

2.3 下調(diào)LSINCT 表達可增強DDP 對A549 細胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表達的影響 Western blot 檢測LSINCT siRNA、DDP 單獨或聯(lián)合使用對A549 細胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表達的影響，結(jié)果如圖3、表3 所示，與空白組比較，DDP 組和si-LSINCT 組E-cadherin 表達明顯升高，Vimentin和N-cadherin 表達明顯降低（P＜0.05），與DDP 組或si-LSINCT 組 比較，si-LSINCT+DDP 組E-cadherin 表達明顯升高，Vimentin 和N-cadherin 表達明顯降低（P＜0.05）。

圖3 LSINCT siRNA、DDP 單獨或聯(lián)合使用對A549 細胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表達的影響Fig.3 Effects of LSINCT siRNA and DDP alone or in combination on expression of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in A549 cells

表3 各組細胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白相對表達量Tab.3 Relative expressions of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in cells of each group

2.4 下調(diào)LSINCT 表達可上調(diào)A549 細胞miR-451基因表達 生物信息學(xué)預(yù)測LSINCT5 可能是miR-451 的靶基因（圖4）。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CLSINCT5和miR-451的靶向關(guān)系，結(jié)果如表4所示，miR-451 mimics 與LSINCT5-WT 共轉(zhuǎn)染可明顯降低熒光素酶活性（P＜0.05），而與LSINCT5-MUT共轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05）。進一步通過qRT-PCR 檢測上調(diào)或下調(diào)LSINCT5 表達后細胞miR-451 基因表達，結(jié)果如表5 所示，下調(diào)LSINCT5 表達可明顯促進miR-451 基因表達，而上調(diào)LSINCT5 表達可明顯抑制miR-451 基因表達（P＜0.05）。提示LSINCT5 和miR-451 存在靶向關(guān)系，LSINCT5可負調(diào)控miR-451的表達。

表4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CLSINCT5 和miR-451靶向關(guān)系Tab.4 Targeting relationship between LSINCT5 and miR-451 were checked by double luciferase reporter gene experiment

表5 上調(diào)或下調(diào)LSINCT 表達后A549 細胞miR-451 基因表達Tab.5 miR-451 gene expression in A549 cells after up or down regulating LSINCT expression

圖4 生物信息學(xué)預(yù)測LSINCT5和miR-451可結(jié)合位點Fig.4 Bioinformatics predicted binding sites of LSINCT5 and miR-451

2.5 抑制LSINCT 可通過上調(diào)miR-451 影響A549細胞侵襲遷移 如圖5、表6 所示，使用LSINCT siRNA、DDP 及anti-miR-451 同時處理細胞，與使用LSINCT siRNA 和DDP 同時處理組比較，細胞侵襲遷、移數(shù)均明顯升高（P＜0.05）。提示LSINCT可通過上調(diào)miR-451影響肺癌細胞對DDP的敏感性。

表6 LSINCT調(diào)控miR-451對A549細胞侵襲、遷移的影響Tab.6 Effects of miR-451 regulated by LSINCT on invasion and migration of A549 cells

圖5 LSINCT調(diào)控miR-451對A549細胞侵襲、遷移的影響Fig.5 Effects of mir-451 regulated by LSINCT on invasion and migration of A549 cells

2.6 抑制LSINCT 可通過調(diào)控miR-451 影響A549細胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表達 Western blot 檢測E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表達結(jié)果，如圖6和表7所示，與si-LSINCT+DDP 組比較，si-LSINCT+DDP+anti-miR-451 組E-cadherin 表 達明 顯降低，Vimentin和N-cadherin表達明顯升高（P＜0.05）。

表7 E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白相對表達量Tab.7 Relative protein expression levels of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin

圖6 LSINCT 調(diào) 控miR-451 對A549 細 胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表達的影響Fig.6 Effects of mir-451 regulated by LSINCT on expression of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in A549 cells

3 討論

多項研究證實，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與lncRNAs 密切相關(guān)，其表達異?？蓪?dǎo)致相關(guān)的生物學(xué)過程紊亂［11］。依據(jù)lncRNAs在腫瘤中的作用可將其分為促癌lncRNAs 和抑癌lncRNAs。最近的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs 也是細胞壓力的重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控細胞的應(yīng)激反應(yīng)［12］。與壓力誘導(dǎo)相關(guān)的lncRNAs與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如壓力誘導(dǎo)因子lncRNAs LET 可影響宮頸癌、胃癌等多種腫瘤細胞生長［13-14］。LSINCT對應(yīng)激反應(yīng)較強，因此定義為壓力誘導(dǎo)lnc-RNA。有研究顯示，多種腫瘤中LSINCT 表達明顯升高，而下調(diào)其表達可抑制癌細胞生長，如LONG 等［15］研究顯示，抑制LSINCT 表達可明顯降低卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移；王莉等［16］研究顯示，抑制LSINCT表達可增強卵巢癌DDP 敏感性。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)LSINCT表達后，肺癌A549細胞侵襲、遷移能力降低，且可增加DDP 對A549 細胞侵襲、遷移的抑制。提示下調(diào)LSINCT可增加肺癌DDP敏感性。

研究表明，miRNA 參與肺癌發(fā)生發(fā)展、耐藥、凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)［17］。miR-451 作為miRNA家族成員，張繼琛等［18］研究顯示，肺癌組織及細胞中miR-451 呈低表達；YIN 等［19］研究顯示，miR-451可抑制肺癌A549 細胞增殖和轉(zhuǎn)移；CHENG［20］研究顯示，miR-451 通過調(diào)節(jié)Mcl-1 增強肺癌細胞對DDP的敏感性。本研究結(jié)果顯示，LSINCT 與miR-451 存在靶向關(guān)系，上調(diào)LSINCT 表達可抑制miR-451 表達，而下調(diào)LSINCT 表達可增強miR-451 表達。抑制miR-451 表達可減弱下調(diào)LSINCT 和順鉑對A549 細胞侵襲、遷移的抑制。提示LSINCT 可通過上調(diào)miR-451增強肺癌DDP敏感性。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。研究表明，EMT 在惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］。在EMT 過程中，多種細胞標志物發(fā)生變化，如上皮標志物E-cadherin 表達降低，間質(zhì)標志物Vimentin、N-cadherin 等表達升高［22］。EMT過程中E-cadherin 表達降低或缺失是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要表現(xiàn)。有研究顯示，上調(diào)EMT 相關(guān)的E-cadherin 表達及下調(diào)Vimentin 和N-cadherin 表達可降低肺癌細胞的侵襲和遷移能力［23-24］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)LSINCT 表達及DDP 均可增強A549 細胞Ecadherin 表達，抑制Vimentin 和N-cadherin 表達，抑制miR-451 表達可減弱下調(diào)LSINCT 和DDP 對A549細 胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表 達 的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LSINCT 可通過上調(diào)miR-451 增強DDP 對肺癌A549 細胞侵襲和遷移影響，抑制EMT。提示LSINCT 可能是肺癌診療的重要分子靶標，值得進一步深入研究。