基于熒光納米粒子的新型冠狀病毒核衣殼蛋白免疫層析快速檢測試劑的研制①

張 賽 王 剛 劉仲明 李輝軍 錢純亙 （深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司，深圳 518116）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是正鏈單股RNA病毒，是已知基因組最大的RNA 病毒之一，有包膜，屬冠狀病毒科。該科分為α、β、δ 和γ 4 個屬，SARSCoV-2為β屬，可引起新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19）［1］。目前SARS-CoV-2 檢測技術主要有分子診斷的熒光定量PCR 技術（RT-PCR）、基因測序技術、基因編輯技術及免疫學檢測的免疫層析法、化學發光法和酶聯免疫吸附法［2-12］。COVID-19確診病例診斷的“金標準”是病毒核酸的檢出，不過，受樣本類型、樣本質量和檢測技術等方面因素限制，基于核酸的檢測存在一定程度的“假陰性”［13］。研究顯示感染SARS-CoV-2 后，人體會在約7 d 時產生針對病毒的IgM 抗體，約14 d 會產生病毒的IgG 抗體，可見基于免疫學的抗體檢測對于病毒的早期篩查并不適用［14］。在實際診斷過程中，抗體檢測法也暴露出較多的假陽性問題，不能單獨作為診斷指標用于篩查，只能作為當核酸檢測為陰性時的輔助診斷方法［15-16］。由于核酸檢測和抗體檢測在診斷中所暴露出的問題，除CT 等臨床癥狀指標外，臨床醫生急需一種能夠快速診斷COVID-19 的方法，以實現對人群的大規模篩查。

基于免疫學的抗原快速檢測技術采用雙抗體夾心法，可有效提高免疫學方法的特異性，減少假陽性的發生；檢測一個樣本僅需10～20 min，可以做到現場快檢，操作簡便，無需特殊設備和人員培訓；同時由于抗原蛋白較穩定，相對于核酸檢測技術對樣本的要求也相對較低［17-19］。目前國內外已上市的抗原快速檢測試劑檢測靈敏度差異較大（30.2%～93.9%），檢測靈敏度偏低與樣本病毒載量及試劑盒質量均有關系［9，20］。本研究采用熒光層析雙抗體夾心法研制SARS-CoV-2 N蛋白抗原快速檢測試劑盒，并對試劑盒的性能指標進行了系統地驗證，以評估試劑盒在快速診斷COVID-19的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 在希臘ROUMPEA 醫學實驗室對有臨床癥狀的SARS-CoV-2 患者及其密切接觸者進行雙份鼻咽拭子樣本采集，一份用于核酸檢測，一份用本研究所制備的抗原檢測試劑盒的檢測，共計89 例；另外用同一批試劑卡對本公司采集的291例健康人群鼻拭子樣本進行檢測。

1.1.2 試劑與儀器 2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白鈉鹽（Casein sodium salt）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、Nonidet P 40（NP-40）、Proclin300 購自美國Sigma 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；海藻糖、Tween 20、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀購自國藥集團上海化學試劑有限公司；羧基熒光納米粒子購自美國Ocean NanoTech 公司；羊抗N 蛋白多克隆抗體、鼠抗N 蛋白單克隆抗體、N 全長重組蛋白購自菲鵬生物有限公司；雞IgY和羊抗雞IgY 抗體購自南京京達生物技術有限公司；SARS-CoV-2滅活培養物購自美國ATCC；其他試劑均為分析純。

Legend Micro 21R 高速微量離心機購自美國Thermo Scientific 公司；XYZ 三維劃膜噴金儀、吸水紙及PVC 底板購自上海金標生物科技有限公司；HGS201 切條機購自杭州峰航科技有限公司；超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q 超純水機購自美國Millipore 公司；納米粒度及Zeta 電位分析儀購自英國Malvern 公司；UNICELL-S 熒光免疫分析儀購自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司；玻璃纖維素膜購自芬蘭Ahlstrom公司；硝酸纖維素購自德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光納米粒子標記偶合物的制備 采用EDC/NHS 法制備熒光納米粒子抗體偶合物［21］。取1 ml（1%）羧基熒光納米粒子于2 ml 低吸附離心管中，12 000 r/min 離心10 min，去除上清，加入1 ml MES 緩沖液（50 mmol/L，pH=6.0），超聲分散；加入EDC、Sulfo-NHS 各5 mg，25 ℃恒溫振蕩反應20 min，12 000 r/min離心10 min，去除上清，再加入1 ml MES緩沖液（50 mmol/L，pH=6.0），超聲分散，12 000 r/min離心10 min，去除上清，重復1 次以除去多余的EDC、Sulfo-NHS。

取活化后的熒光納米粒子，加入1 ml MES 緩沖液（50 mmol/L，pH6.5），超聲分散；加入0.4 mg 羊抗N 蛋白多克隆抗體或雞IgY 抗體，25 ℃恒溫振蕩反應2 h，12 000 r/min離心10 min，去除上清；加入1 ml封閉液（50 mmol/L Tris，pH=8.0，0.5% BSA），超聲分散，12 000 r/min 離心10 min，去除上清；加入1 ml保存液（50 mmol/L Tris，pH=8.0，0.5%酪蛋白鈉鹽，0.1%Tween 20，10%海藻糖，0.05%Proclin300），超聲分散，4 ℃避光保存。

1.2.2 熒光偶合物顆粒平均直徑及Zeta 電位測試 用超純水將熒光納米粒子和標記后的熒光納米粒子抗體偶合物稀釋100 倍，取1 ml 加入比色皿中，放入納米粒度儀測定顆粒的平均直徑、分布系數PDI及Zeta電位。

1.2.3 抗原檢測試劑的制備 將玻璃纖維素膜用樣本墊處理液涂布處理，45 ℃烘干12 h。用偶合物稀釋液稀釋熒光納米粒子標記的羊抗N蛋白多克隆抗體偶合物和雞IgY 抗體偶合物，體積占比分別為15%和2%，用XYZ 三維劃膜噴金儀按4 μl/cm 在偶合物墊上平行噴兩條線，45 ℃干燥24 h。用含有0.01 mol/L pH7.4 PBS，5%海藻糖的包被液分別稀釋鼠抗N 蛋白單克隆抗體、羊抗雞IgY 抗體至2.0 mg/ml和1.0 mg/ml，分別作為檢測線（T線）和質控線（C 線）捕獲抗體包被在硝酸纖維膜（NC 膜）上，45 ℃烘干48 h。將制備好的NC 膜、偶合物墊、樣本墊及吸水墊依次粘貼在PVC 底板上，用切條機裁切為4.0 mm/條，裝入檢測卡，鋁箔袋封裝。

測試時將鼻拭子或鼻咽拭子插入預裝有提取液（10 mmol/L PBS，pH=7.4，1% NP-40）的提管中，抽提15 s后滴加3滴（100 μl）至檢測卡加樣孔，反應15 min 后進行熒光免疫分析儀測試。試劑ID 卡內置臨界信號值，樣本信號與臨界信號（陰性樣本信號值加3 倍標準偏差）的比值作為測試結果，單位“COI”，結果≥1 COI 為陽性，＜1 COI 為陰性。試紙條結構、原理及測試過程如圖1、圖2所示。

圖1 試紙條結構及原理圖Fig.1 Schematic diagram of structure and principle of antigen test strip

圖2 測試過程Fig.2 Procedure for assay

1.2.4 最低檢出限 用健康人群鼻拭子洗脫液作為陰性基質將N 全長重組蛋白從1 000 pg/ml 2 倍梯度稀釋，每個濃度取100 μl 加樣，重復10 次，以N 蛋白濃度為橫坐標，熒光信號T/C 值為縱坐標建立標準曲線。參照CLSI E17-A2 文件［22］進行最低檢出限研究，LOD=LOB+1.653×SDlowpositive。其中LOB為空白限，選擇5 個空白樣本，每個樣本測試4 次，連續測試3 d，共60 個結果；SDlow positive為低濃度樣本標準偏差，選擇5 個低值樣本，每個樣本測試4 次，連續測試3 d，共60個結果。

用熱滅活病毒培養物（ATCC，貨號VR-1986HKTM，批號70036071，濃度1.6×105TCID50/ml）進行最低檢出限研究。選用健康人群鼻拭子洗脫液作為陰性基質，先10 倍梯度稀釋，測試出現陰性結果后從上一濃度再2 倍梯度稀釋，選擇20 次測試中≥19 次陽性的濃度水平（≥95%）作為試劑的最低檢出限。

1.2.5 交叉反應分析 本實驗室收集的肺炎支原體、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、冠狀病毒OC43、冠狀病毒229E、冠狀病毒NL63、甲型H1N1 流感病毒、甲型H3N2 流感病毒、新型甲型H1N1 流感病毒（2009）、乙型流感Victoria、乙型流感Yamagata、呼吸道合胞病毒A 型、呼吸道合胞病毒B 型、腺病毒3 型共計16 種呼吸道病原體高濃度毒株進行交叉反應測試，每個病原體測試1次。

1.2.6 重復性測試 選擇62.5 pg/ml 和500 pg/ml兩個濃度的N 蛋白參考品進行重復性測試，每個濃度重復測試10次，統計變異系數（CV%）。

1.2.7 臨床性能評價 在希臘ROUMPEA 醫學實驗室用圣湘生物iPonatic 快速核酸檢測系統及本研究所制備的抗原檢測試劑盒同時取鼻咽拭子樣本進行臨床比對測試；用同一批試劑卡對本公司采集的291例健康人群鼻拭子樣本進行特異性檢測。

1.3 統計學分析 使用IBM SPSS20.0 軟件對數據進行統計分析，采用Kappa檢驗，統計分析所研制的新型冠狀病毒抗原檢測試劑的臨床性能。

2 結果

2.1 熒光偶合物粒徑和Zeta 電位分析 采用動態光散射法（DLS）表征熒光納米粒子及熒光納米粒子偶合物的粒徑大小及分布［23］，結果如表1 和圖3 所示，熒光納米粒子的平均直徑為（610.80±5.66）nm，分布系數PDI 為0.15±0.02，近單分散體系，表明熒光納米粒子粒徑均一，尺寸分布較窄。Zeta 電位是表征膠體分散系穩定性的重要指標，體系穩定與否通常以Zeta電位是否＞±30 mV為標準［24］，本研究所采用的熒光納米粒子Zeta 電位為-（42.95±0.78）mV，表明熒光納米粒子溶液穩定性較好。

從表1和圖3中可以看出，羊抗N蛋白多克隆抗體及雞IgY 熒光納米粒子偶合物與未標記的熒光納米粒子相比，粒徑和分布系數變化不明顯，均尺寸分布較窄，近單分散體系；與熒光納米粒子相比，羊抗N 蛋白抗體偶合物、雞IgY 抗體偶合物的Zeta 電位絕對值均增大，體系處于更加穩定的狀態，電位增大的原因可能是熒光納米粒子表面共價結合的抗體蛋白也帶負電荷。

圖3 熒光納米粒子及熒光納米粒子偶合物粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of fluorescent nanoparticles and its coupling

表1 熒光納米粒子及熒光納米粒子偶合物粒徑和Zeta電位Tab.1 Particle size and zeta potential of fluorescent nanoparticles and its coupling

2.2 最低檢出限 N 蛋白濃度與信號值T/C 的標準曲線如圖4 所示，擬合曲線采用2 次多項式，y=0.036 7+3.819×10-4x-6.456×10-8x2，R2=0.999 1。各濃度N 蛋白峰型圖如圖5 所示，峰基線平整，各濃度N蛋白T峰區分明顯。60個空白樣本結果正態性檢驗為非正態，故采用95百分位數法，計算出LOB=7.0 pg/ml；60 個低值樣本結果正態性檢驗為正態，故參照1.2.4公式，計算出LOD=13.8 pg/ml。

圖4 NP蛋白檢測標準曲線Fig.4 Standard curve of NP protein

圖5 各濃度NP蛋白峰型圖Fig.5 Peak pattern of NP protein at different concentrations

熱滅活病毒培養物梯度稀釋測試，濃度為1.6×102TCID50/ml時，檢測20次有19次測試為陽性，1次陰性，故本研究所制備的抗原檢測試劑盒檢測熱滅活病毒培養物的最低檢出限為1.6×102TCID50/ml。

2.3 交叉反應性 16 種呼吸道病原體樣本信息及測試結果如表2 所示，各病原體樣本測試COI 均＜1，結果為陰性，無交叉反應性，表明試劑特異性較好。

2.4 重復性測試 62.5 pg/ml 和500 pg/ml 兩個濃度的N 蛋白參考品重復性測試結果如表3 所示，變異系數分別為4.98%和7.68%，表明試劑重復性較好。

表3 重復性測試結果Tab.3 Repeatability test results

2.5 臨床性能評價 希臘ROUMPEA 醫學實驗室臨床評估統計結果如表4所示，與RT-PCR檢測結果比較，靈敏度為86.36%（19/22），95%CI：65.09%～97.09%；特異度為97.01%（65/67），95%CI：89.63%～99.64%。其中3 例漏檢樣本，RT-PCR 測試CT 值均為灰區，2 例假陽樣本測試結果COI 分別為2.40 和1.06，結果數值分布如圖6所示。

圖6 臨床測試結果分布Fig.6 Distribution of clinical test results

表4 臨床性能評價Tab.4 Results of clinical performance evaluation

用同一批試劑卡對本公司采集的291例健康人群鼻拭子樣本進行檢測，291 例樣本出現1 例假陽性，結果為2.82 COI，健康人群抗原檢測特異性為99.66%（290/291）。

將希臘ROUMPEA 醫學實驗室及本公司測試的健康人群樣本合并統計，靈敏度為86.36%（19/22），95%CI：65.09%～97.09%，特異度為99.16%（355/358），95%CI：97.57%～99.83%，總符合率為98.42%（374/380），95%CI：96.60%～99.42%；Kappa 檢驗一致性較好，Kappa 值為0.855 3，P＜0.05。試驗結果表明，本研究研制的SARS-CoV-2 抗原檢測試劑盒靈敏度和特異度良好，與臨床診斷符合率較高，可作為SARS-CoV-2感染的有效篩查和診斷指標。

3 討論

本研究采用雙抗體夾心熒光免疫層析法制備N蛋白抗原快速檢測試劑，可有效避免RT-PCR 法的假陰性和抗體檢測法的假陽性問題，診斷快速、準確，對設備和人員要求低，非常適合大規模SARSCoV-2 感染疑似病例的快速排查，對疫情集中暴發的快速診斷非常有效。也可以作為出院病例核酸檢測的再次確診方法，避免假陰性患者出院造成新的傳播風險。

LAMBERT-NICLOT 等［25］采用比利時Coris Bio-Concept公司的膠體金法COVID-19抗原檢測試劑測試了94例SARS-CoV-2 RT-PCR 陽性鼻咽拭子樣本，共檢出抗原陽性47 例，靈敏度僅50%，其中CT 值≤25 樣本的靈敏度為82.2%，樣本中病毒載量越高試劑靈敏度越高，試劑特異度100%。NALUMANSI等［18］采用韓國SD公司膠體金法COVID-19抗原檢測試劑與RT-PCR同時檢測262例鼻拭子樣本，結果靈敏度和特異度分別為70%和92%，其中CT 值≤29，樣本的靈敏度為92%，同樣樣本中病毒載量越高試劑靈敏度越高。本研究所制備的抗原快速檢測試劑盒，靈敏度為86.36%（19/22），特異度為99.16%（355/358），其中3 例漏檢樣本CT 值處于灰區，說明樣本中病毒載量并不高，試劑靈敏度表現優異。本研究測試了16 種常見呼吸道病原體高濃度樣本均無交叉反應，出現3 例弱陽性樣本可能與樣本中其他未知干擾物質有關，有待進一步研究和優化，但總體上特異度能夠滿足臨床需求。因開發時間有限，本試劑盒實時穩定性會持續進行驗證。研究發現，COVID-19感染患者的唾液及尿液樣本中同樣可以檢測出N 蛋白［26-27］。本研究開發的試劑盒目前可用于檢測鼻拭子或鼻咽拭子樣本，取樣時對人體有侵入性且容易使采集者暴露在帶病毒的氣溶膠中，后期可將檢測樣本類型拓展到唾液、尿液等標本上。

綜上所述，本研究開發的SARS-CoV-2 抗原快速檢測試劑（熒光免疫層析法）具有便捷、快速，靈敏度和特異度高的優點。該SARS-CoV-2 抗原檢測產品可用于為疑似患者快速輔助診斷及重點人群快速輔助排查，促進患者早期診斷與及時干預，這對于SARS-CoV-2感染的診斷和防控具有重要意義。