MCM4基因在子宮內(nèi)膜癌中表達和臨床意義的生物信息學分析①

魏 敏 王麗娜 白雪飛 滕 菲 王 靜

（蘭州大學第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅省婦科腫瘤重點實驗室，蘭州 730000）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占婦科惡性腫瘤的20%～30%，女性惡性腫瘤的7%［1］。隨著人口出生率的下降和肥胖患者的增加，其發(fā)病率和病死率正在逐年上升［2-3］。有數(shù)據(jù)表明，75%的EC 患者可以在早期診斷，其五年生存率可達65%～92%［4-5］。但對于晚期和復(fù)發(fā)患者，以及臨床侵襲性強的組織學類型（如高級別子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌）患者，臨床預(yù)后往往較差［6］。因此，早期篩查和準確診斷是改善患者結(jié)局的關(guān)鍵，但目前的生物標志物不足以對其進行早期和準確的診斷。因此，尋找新的敏感的生物標志物以改善診斷具有重要意義。

微小染色體維持蛋白4（mini chromosome maintenance proteins 4，MCM4）屬于微小染色體維持蛋白家族，是MCM2-7 六聚體復(fù)合體的組成部分，具有ATP 酶活性，是解開DNA 雙螺旋解旋酶的核心，并參與復(fù)制叉的形成［7］。研究發(fā)現(xiàn)，MCM4 異常表達可促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生，且在多種腫瘤中可作為一個有價值的預(yù)后標志物。然而，MCM4在EC 中的作用機制仍不明確。

本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，比較了MCM4在EC 和正常子宮內(nèi)膜組織中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的差異表達，評估了MCM4 mRNA 表達與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，回顧性分析了MCM4 mRNA表達與EC患者預(yù)后的關(guān)系，并探討了MCM4 的共表達基因及可能的生物學功能，為EC的診斷提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫MCM4 mRNA 表達水平和臨床數(shù)據(jù)下載 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中下載子宮內(nèi)膜癌（UCEC）患者的mRNA表達數(shù)據(jù)及臨床信息，用R 軟件（v3.6.3）和Perl 語言處理并整合數(shù)據(jù)，共得到552 例EC 組織和35 例正常子宮內(nèi)膜組織（包含23 對配對的癌和癌旁組織）數(shù)據(jù)。將552 例EC 標本以MCM4 mRNA 表達量中位值為界，分為高表達組和低表達組。

1.2 HPA 和Ualcan 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 蛋白的表達 研究選取人類蛋白表達圖譜數(shù)據(jù)庫（Human Protein Atlas，HPA）中的免疫組織化學抗體（HPA004873），分析EC 和正常子宮內(nèi)膜組織中MCM4蛋白的表達及染色程度。

通過檢索臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)作組數(shù)據(jù)集（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC），再次驗證MCM4 蛋白在100 例EC 組織和31例正常子宮內(nèi)膜組織中的表達。

1.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫EC 中MCM4 的共表達基因及富集分析 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫mRNA 表達數(shù)據(jù)，以|cor| ＞0.3 和P＜0.05 為閾值，用R 軟件“stat”包分析子宮內(nèi)膜中MCM4 的共表達基因，以FDR＜0.2 和P＜0.05 為閾值，“clusterProfiler”包進行富集分析，“ggplot2”包可視化結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理 研究中所有的統(tǒng)計分析均采用R 語言軟件（v3.6.3）完成，ROC 曲線由“pROC”包生成，MCM4基因在EC 組織與正常子宮內(nèi)膜組織間的表達差異采用Mann-WhitneyU檢驗，配對樣本間的差異采用配對t檢驗，MCM4 mRNA 表達水平與病理參數(shù)間的相關(guān)性采用Logistic 檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 和Cox 分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中EC 患者MCM4 mRNA 表達情況 研究發(fā)現(xiàn)MCM4 mRNA 在EC 組織中的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05，圖1A）及配對的癌旁組織（P＜0.05，圖1B）；MCM4 mRNA 的表達量在Ⅲ/Ⅳ期患者較Ⅰ/Ⅱ期患者明顯增高（P＜0.05，圖1C），高級別（G2/G3）患者較低級別（G1）患者明顯增高（P＜0.05，圖1D），漿液性EC患者較子宮內(nèi)膜樣腺癌患者明顯增高（P＜0.05，圖1E）。當MCM4 mRNA 表達的界值為2.902 時，ROC 曲線下面積為0.966（圖1F）。

圖1 MCM4 mRNA在EC組織中的差異表達和ROC曲線Fig.1 Differential expression of MCM4 gene in EC tissues and ROC curve

2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中MCM4 mRNA 表達與EC 患者臨床特征的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)，MCM4 mRNA 高表達水平與FIGO 分期（ⅢvsⅠ，P=0.014）、組織學類型（serousvsendometrioid，P＜0.001）和 組 織 學 分 級（G2vsG1，G3vsG1，P＜0.001）密切相關(guān)（表1）。

表1 MCM4 mRNA表達與EC臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Association between MCM4 mRNA expression and clinicopathological characteristics of EC

2.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫中MCM4 mRNA 表達水平與EC患者不良預(yù)后相關(guān) Kaplan-Meier 分析顯示，MCM4 mRNA 高表達組EC 患者總生存期明顯縮短（P=0.001，圖2A），在子宮內(nèi)膜樣腺癌中MCM4 mRNA高表達組患者總生存期也明顯縮短（P=0.001，圖2B）。單因素Cox 分析表明MCM4 mRNA 的表達水平、FIGO 分期、組織學分級、病理類型、肌層浸潤深度和年齡與患者的不良預(yù)后相關(guān)（表2），多因素Cox 分析表明FIGO 分期、組織學分級和MCM4 表達量是影響EC患者總生存率的獨立危險因素（表2）。

表2 EC預(yù)后影響因素的單因素、多因素Cox回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression of EC overall survival

圖2 MCM4 mRNA表達與EC患者生存率的關(guān)系Fig.2 Correlation between expression of MCM4 mRNA and survival rate of EC patients

2.4 MCM4蛋白在EC 組織中高表達 HPA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，MCM4 蛋白主要表達于EC 細胞核，EC 組織中MCM4 蛋白表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（圖3A、B）；CPTAC 數(shù)據(jù)庫證實了同樣的結(jié)果，MCM4 蛋白在EC 組織中的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.001，圖3C）。

圖3 MCM4蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達Fig.3 Differential expression of MCM4 protein in EC tissues

2.5 EC 中MCM4共表達基因功能富集分析 為了探究EC中MCM4潛在的分子機制，本研究進行了共表達基因功能富集分析。結(jié)果顯示與MCM4正相關(guān)的基因有3 383個，負相關(guān)的基因有705個。熱圖分別展示前20 個與MCM4 正相關(guān)（圖4A）和負相關(guān)（圖4B）的共表達基因，功能富集分析結(jié)果顯示，共表達基因主要富集于細胞周期、DNA 復(fù)制和范科尼貧血通路，其主要的分子功能是保持解旋酶活性和DNA依賴的ATP酶活性（圖4C）。

圖4 EC中與MCM4的共表達基因及生物學功能分析Fig.4 Co-expression gene and biological function analysis of MCM4 in EC

3 討論

EC是一種由異常腺體增生引起的，伴有基因和蛋白異常表達的常見惡性腫瘤［8］，因缺乏精確的診斷和治療的分子靶標，全世界EC 患者的病死率正逐年上升。

微小染色體維持蛋白家族（mini-chromosome maintenance proteins，MCMs）是由9 個相關(guān)蛋白質(zhì)（MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、MCM8、MCM9、MCM10）組成的一類細胞內(nèi)蛋白，在DNA復(fù)制和細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用［9］。在這些蛋白質(zhì)中，MCM2-7形成一種DNA解旋酶復(fù)合體，在啟動DNA 復(fù)制起點、激活DNA 復(fù)制和促進DNA合 成中發(fā)揮重要作用［9］。MCM4 主要參與S 期前DNA 復(fù)制的起始，不正確的復(fù)制叉進程可導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，潛在的不完整的DNA 復(fù)制和破裂的復(fù)制叉結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂［10-11］。因此，MCM4 蛋白在維持基因組完整性方面發(fā)揮重要作用，MCM4蛋白表達異常有助于細胞增殖和腫瘤發(fā)生。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，MCM4在乳腺癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達［12-17］。本研究證實了MCM4 mRNA 在EC 中的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜及配對的癌旁組織。在蛋白水平上同樣證實MCM4 在EC 中的表達明顯高于正常組織。ROC 分析顯示，MCM4 具有較高的診斷價值，這些結(jié)果表明MCM4是診斷EC的潛在分子靶標。

多項研究報道，MCM4 異常表達與多種腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，是一個預(yù)測患者預(yù)后的可靠指標，甚至可能成為治療靶點。XU 等［18］研究發(fā)現(xiàn)MCM4 高表達肝癌患者的臨床分期更晚，生存時間更短，沉默MCM4 可顯著抑制肝癌細胞的增殖和肝癌移植瘤的生長。HAN 等［19］證實MCM4 在喉鱗狀細胞癌中高表達，與患者的不良預(yù)后相關(guān)，是一個有價值的預(yù)后指標，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)MCM4 mRNA 的表達與EC 患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)，多因素Cox 回歸分析提示，MCM4高表達是EC 患者的獨立危險因素，進一步表明，MCM4 是EC 的致病基因。子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜最常見的病理類型，本研究同樣發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中MCM4 mRNA的表達與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。幾乎所有的EC 風險分層系統(tǒng)都綜合了臨床分期、組織學類型和分級［20］，本研究中單因素Cox 回歸分析和Logistic 分析結(jié)果顯示，MCM4 mRNA 的表達與EC 患者的FIGO 分期、組織學類型和組織學分級密切相關(guān)，表明MCM4可能是EC的潛在治療靶點。通過對其共表達基因富集分析發(fā)現(xiàn)，其可能的機制是通過細胞周期、DNA 復(fù)制和范科尼貧血通路而導(dǎo)致EC 的發(fā)生。SAINI 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在EC 細胞株中沉默CYP1B1 后，可顯著下調(diào)MCM4表達，這為課題組進一步在EC 細胞系中研究MCM4的致病分子機制提供了可靠依據(jù)。

綜上所述，本研究證實了MCM4在EC中的診斷和預(yù)后價值，但研究仍然存在不足之處，課題組只進行了生物信息學分析，未在臨床樣本中驗證，同時，應(yīng)在EC 細胞系中進行其生物學功能及機制的研究，這將是課題組后續(xù)研究的方向。